Krav
Patentkrav1. Nukleotidmolekyl, omfattende en konstruert diversitetsregion av den tunge immunglobulinkjede (DH) ("konstruert DH-region"), omfattende:(i) et konstruert DH-gensegment, omfattende et DH-gensegment umiddelbart naboliggende en 23-mer-RSS ("konstruert DH-gensegment") og(ii) et ikke-rearrangert DH-gensegment, flankert på sin 5'-side av en første 12-mer-RSS og på sin 3'-side av en andre 12-mer-RSS ("ikke-rearrangert DH-gensegment"),hvor (i) det konstruerte DH-gensegment og (ii) det ikke-rearrangerte DH-gensegment er operabelt koblet slik at (i) det konstruerte DH-gensegment og (ii) det ikke-rearrangerte DH-gensegment er i stand til å forbinde seg i en DH-DH-rekombinasjonshendelse ifølge 12/23-regelen,hvor nukleotidmolekylet egner seg for oppnåelse av gnagere som har den konstruerte DH-region, ogvalgfritt hvor den konstruerte DH-region omfatter kun humane DH-gensegmenter.2. Nukleotidmolekyl ifølge krav 1, hvor nukleotidmolekylet videre omfatter:(a) minst ett ikke-rearrangert variabelt gensegment av den tunge immunglobulinkjede (VH) ("ikke-rearrangert VH-gensegment") som er oppstrøms av og operabelt koblet til den konstruerte DH-region;(b) minst ett ikke-rearrangert forbindende gensegment av den tunge immunglobulinkjede (JH) ("ikke-rearrangert JH-gensegment") som er nedstrøms av og operabelt koblet til den konstruerte DH-region; eller (c) en kombinasjon av (a) og (b).3. Nukleotidmolekyl ifølge krav 2, hvor:(a) det minst ene ikke-rearrangerte VH-gensegment omfatter et ikkerearrangert humant VH6-1-gensegment, idet det minst ene ikke-rearrangerte JH-gensegment omfatter et ikke-rearrangert humant JH6-gensegment, eller en kombinasjon derav; (b) det minst ene ikke-rearrangerte JH-gensegment omfatter et ikkerearrangert humant JH4-gensegment, et ikke-rearrangert JH5-gensegment og et ikke-rearrangert humant JH6-gensegment;(c) det minst ene ikke-rearrangerte JH-gensegment omfatter et ikkerearrangert humant JH1-gensegment, et ikke-rearrangert humant JH2-gensegment, et ikke-rearrangert humant JH3-gensegment, et ikkerearrangert humant JH4-gensegment, et ikke-rearrangert humant JH5-gensegment og et ikke-rearrangert humant JH6-gensegment, valgfritt hvor det ikke-rearrangerte humane JH1-gensegment, det ikke-rearrangerte humane JH2-gensegment, det ikke-rearrangerte humane JH3-gensegment, det ikke-rearrangerte humane JH4-gensegment, det ikke-rearrangerte humane JH5-gensegment og det ikke-rearrangerte humane JH6-gensegment er i kimbanekonfigurasjon; og/eller(d) det minst ene ikke-rearrangerte VH-gensegment omfatter det fullstendige repertoar av funksjonelle ikke-rearrangerte humane VH-gensegmenter som strekker seg mellom og innbefatter et ikke-rearrangert humant VH3-74-gensegment og et ikke-rearrangert humant VH1-6-gensegment ("fullstendig repertoar av funksjonelle ikke-rearrangerte humane VH-gensegmenter"), valgfritt hvor det fullstendige repertoar av funksjonelle ikke-rearrangerte humane VH-gensegmenter er i kimbanekonfigurasjon.4. Nukleotidmolekyl ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor:(a) nukleotidmolekylet videre omfatter ett eller flere funksjonelle gnager-Adam6-gener, valgfritt hvor det ene eller de flere funksjonelle gnager-Adam6-gener er anordnet mellom et humant VH1-2-gensegment og et humant VH6-1-gensegment og/eller erstatter et humant Adam6-gen;(b) det konstruerte DH-gensegment omfatter 23-mer-RSS-en umiddelbart naboliggende 5'-enden av DH-gensegmentet;(c) det konstruerte DH-gensegment omfatter 23-mer-RSS-en umiddelbart naboliggende 3'-enden av DH-gensegmentet;(d) det konstruerte DH-gensegment omfatter: (i) et humant DH3-3-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS-en, valgfritt hvor 23-mer-RSS-en er umiddelbart naboliggende 5'-enden av DH3-3-gensegmentet;(ii) et humant DH2-2-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS-en, valgfritt hvor 23-mer-RSS-en er umiddelbart naboliggende 3'-enden av DH2-2-gensegmentet;(iii) et humant DH2-8-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS-en, valgfritt hvor 23-mer-RSS-en er umiddelbart naboliggende 3'-enden av DH2-8-gensegmentet;(iv) et humant DH2-15-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS-en, valgfritt hvor 23-mer-RSS-en er umiddelbart naboliggende 3'-enden av DH2-15-gensegmentet; eller(v) en hvilken som helst kombinasjon av (i)-(iv);(e) nukleotidmolekylet omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO:52 eller omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO:61;(f) nukleotidmolekylet omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO:70; (g) nukleotidmolekylet omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO:71; og/eller(h) nukleotidmolekylet omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO:72.5. Nukleotidmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, omfattende i operabel forbindelse fra 5' til 3':(a) minst ett ikke-rearrangert humant VH-gensegment,(b) den konstruerte DH-region, hvor det konstruerte DH-gensegment omfatter et humant DH3-3-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS-en, hvor 23-mer-RSS-en er umiddelbart naboliggende 5'-enden av det humane DH3-3-gensegment, og(c) minst ett ikke-rearrangert humant JH-gensegment.6. Nukleotidmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, omfattende i operabel forbindelse fra 5' til 3':(a) minst ett ikke-rearrangert humant VH-gensegment, (b) den konstruerte DH-region, hvor det konstruerte DH-gensegment omfatter et humant DH2-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS-en, hvor 23-mer-RSS-en er umiddelbart naboliggende 3'-enden av det humane DH2-gensegment, valgfritt hvor:(i) det konstruerte DH-gensegment omfatter et humant DH2-2-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS;(ii) det konstruerte DH-gensegment omfatter et humant DH2-8-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS;(iii) det konstruerte DH-gensegment omfatter et humant DH2-15-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS; eller(iv) en hvilken som helst kombinasjon derav, og(c) minst ett ikke-rearrangert humant JH-gensegment.7. Nukleotidmolekyl ifølge krav 5 eller krav 6, hvor:(a) det minst ene ikke-rearrangerte humane VH-gensegment omfatter fra 5' til 3' et ikke-rearrangert humant VH1-2-gensegment og et ikke-rearrangert humant VH6-1-gensegment, hvor nukleotidet videre omfatter ett eller flere funksjonelle gnager-Adam6-gener mellom det ikke-rearrangerte humane VH1-2-gensegment og det ikke-rearrangerte humane VH6-1-gensegment, og hvor det ikke-rearrangerte humane VH1-2-gensegment, det ene eller de flere funksjonelle gnager-Adam6-gener og det ikke-rearrangerte humane VH6-1-gensegment er sammenhengende;(b) det minst ene ikke-rearrangerte humane VH-gensegment omfatter det fullstendige repertoar av funksjonelle ikke-rearrangerte humane VH-gensegmenter, valgfritt hvor det fullstendige repertoar av funksjonelle ikkerearrangerte humane VH-gensegmenter er i kimbanekonfigurasjon; og/eller (c) det minst ene ikke-rearrangerte humane JH-gensegment omfatter et ikkerearrangert humant JH6-gensegment, valgfritt hvor:(i) det minst ene ikke-rearrangerte humane JH-gensegment omfatter et ikkerearrangert humant JH4-gensegment, et ikke-rearrangert JH5-gensegment og det ikke-rearrangerte humane JH6-gensegment; og/eller(ii) hvor det minst ene ikke-rearrangerte humane JH-gensegment omfatter et ikke-rearrangert humant JH1-gensegment, et ikke-rearrangert humant JH2gensegment, et ikke-rearrangert humant JH3-gensegment, et ikkerearrangert humant JH4-gensegment, et ikke-rearrangert humant JH5-gensegment og et ikke-rearrangert humant JH6-gensegment, videre valgfritt hvor det ikke-rearrangerte humane JH1-gensegment, det ikke-rearrangerte JH2-gensegment, det ikke-rearrangerte JH3-gensegment, det ikkerearrangerte JH4-gensegment, det ikke-rearrangerte JH5-gensegment og det ikke-rearrangerte JH6-gensegment er i kimbanekonfigurasjon.8. Nukleotidmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, som videre omfatter:(a) på sin 3'-ende, en konstant region av den tunge immunglobulinkjede (CH) eller et avsnitt derav;(b) på sin 3'-ende, en gnager CH-region eller et avsnitt derav;(c) på sin 3'-ende, en gnager-CH-region eller et avsnitt derav, omfattende en intronisk gnager-forsterkerregion og et gnager-IgM-gen; og/eller(d) en legemiddelutvalgskassett som befinner seg oppstrøms av det konstruerte DH-gensegment, valgfritt hvor legemiddelutvalgskassetten er flankert av ett eller flere stedsspesifikke rekombinasjonssteder.9. Målvektor, omfattende et nukleotidmolekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, omfattende 5'- og 3'-homologiarmer som er konfigurert til å tillate homolog rekombinasjon med en sekvens av den tunge immunglobulinkjede på et endogent locus av den tunge immunglobulinkjede av en gnager, valgfritt hvor sekvensen av den tunge immunglobulinkjede omfatter en human eller humanisert variabel region av den tunge immunglobulinkjede.10. Fremgangsmåte for modifisering av en variabel region av den tunge immunglobulinkjede for å konstruere DH-DH-rekombinasjon, idet fremgangsmåten omfatter:(a) å oppnå en sekvens av den variable kjede av den tunge immunglobulinkjede, omfattende en DH-region, omfattende ett eller flere ikkerearrangerte DH-gensegmenter, hvorav hvert ikke-rearrangerte DH-gensegment er flankert på sin 5'-side av en første 12-mer-RSS og på sin 3'-side av en andre 12-mer-RSS, valgfritt hvor det ene eller de flere ikke-rearrangerte DH-gensegmenter omfatter minst ett ikke-rearrangert humant DH-gensegment, videre valgfritt hvor det minst ene ikke-rearrangerte humane DH-gensegment omfatter alle de funksjonelle humane DH-gensegmenter som strekker seg mellom og innbefatter et ikke-rearrangert humant DH1-1-gensegment og et ikkerearrangert humant DH7-27-gensegment, valgfritt hvor alle de funksjonelle humane DH-gensegmenter er i kimbanekonfigurasjon, og(b) å konstruere DH-regionen til videre å omfatte minst ett konstruert DH-gensegment, hvor det konstruerte DH-gensegment omfatter et DH-gensegment umiddelbart naboliggende en 23-mer-RSS,hvor, i den resulterende konstruerte DH-region, er det konstruerte DH-gensegment og minst ett av det ene eller de flere ikke-rearrangerte DH-gensegmenter operabelt koblet og i stand til å ta del i en DH-DH-rekombinasjonshendelse ifølge 12/23-regelen,valgfritt hvor den resulterende konstruerte DH-region omfatter kun humane DH-gensegmenter.11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, hvor DH-regionen ifølge krav 10(a) omfatter to eller flere ikke-rearrangerte DH-gensegmenter, hvorav hvert er flankert på sin 5'-side av en første 12-mer-RSS og på sin 3'-side av en andre 12-mer-RSS, oghvor konstruering omfatter(a) å erstatte minst ett av de to eller flere ikke-rearrangerte DH-gensegmenter med det konstruerte DH-gensegment som definert i krav 10(b),(b) å erstatte den første 12-mer-RSS eller den andre 12-mer-RSS av minst ett av de to eller flere ikke-rearrangerte DH-gensegmenter med en 23-mer-RSS, eller(c) en kombinasjon av (a) og (b),valgfritt hvor sekvensen av den variable kjede av den tunge immunglobulinkjede videre omfatter en JH-region, omfattende minst ett ikkerearrangert JH-gensegment,hvor JH-regionen er operabelt koblet til DH-regionen, og hvor å erstatte minst ett av de to eller flere ikke-rearrangerte DH-gensegmenter med det konstruerte DH-gensegment som definert i krav 10(b), omfatter å deletere det minst ene ikke-rearrangerte JH-gensegment, videre valgfritt hvor JH-regionen omfatter et fullstendig repertoar av humane kimbane-JH-gensegmenter, omfattende et ikke-rearrangert humant JH1-gensegment, et ikke rearrangert humant JH2-gensegment, et ikkerearrangert humant JH3-gensegment, et ikke-rearrangert humant JH4-gensegment, et ikke-rearrangert humant JH5-gensegment og et ikkerearrangert humant JH6-gensegment, valgfritt hvor det ikke-rearrangerte humane JH1-gensegment, det ikke-rearrangerte humane JH2-gensegment, det ikke-rearrangerte humane JH3-gensegment, det ikke-rearrangerte humane JH4-gensegment, det ikke-rearrangerte humane JH5-gensegment og det ikke-rearrangerte humane JH6-gensegment er i kimbanekonfigurasjon, oghvor å deletere minst ett kimbane-JH-gensegment omfatter å deletere det ikke-rearrangerte humane JH1-gensegment, det ikke-rearrangerte humane JH2-gensegment og det ikke-rearrangerte humane JH3-gensegment, og valgfritt videre å deletere det ikke-rearrangerte humane JH4-gensegment og det ikke-rearrangerte humane JH5-gensegment.12. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11, hvor:(a) det konstruerte DH-gensegment ifølge krav 10(b) omfatter(i) et humant DH3-3-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS-en, valgfritt hvor 23-mer-RSS-en er umiddelbart naboliggende 5'-enden av DH3-3-gensegmentet,(ii) et humant DH2-2-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS-en, valgfritt hvor 23-mer-RSS-en er umiddelbart naboliggende 3'-enden av DH2-2-gensegmentet,(iii) et humant DH2-8-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS-en, valgfritt hvor 23-mer-RSS-en er umiddelbart naboliggende 3'-enden av DH2-8-gensegmentet, (iv) et humant DH2-15-gensegment umiddelbart naboliggende 23-mer-RSS-en, valgfritt hvor 23-mer-RSS-en er umiddelbart naboliggende 3'-enden av DH2-15-gensegmentet, eller(v) en hvilken som helst kombinasjon av (i)-(iv);(b) konstruering omfatter å erstatte det mest 3' ikke-rearrangerte DH-gensegment av DH-regionen som definert i krav 10(a), med det konstruerte DH-gensegment som definert i krav 10(b); og/eller(c) konstruering omfatter å erstatte minst ett av det ene eller de flere ikkerearrangerte DH-gensegmenter som svarer til det konstruerte DH-gensegment som definert i krav 10(b), med det konstruerte DH-gensegment som definert i krav 10(b).13. Locus av den tunge immunglobulinkjede, omfattende nukleotidmolekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, målvektoren ifølge krav 9 eller den variable region av den tunge immunglobulinkjede, modifisert ifølge fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 10-12.14. Gnagergenom, omfattende nukleotidmolekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, målvektoren ifølge krav 9, den variable region av den tunge immunglobulinkjede modifisert ifølge fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 10-12, eller locuset av den tunge immunglobulinkjede ifølge krav 13, hvor gnagergenomet valgfritt er et gnager-kimbanegenom.15. Gnagergenom ifølge krav 14, hvor gnagergenomet omfatter en variabel region av den tunge immunglobulinkjede som omfatter:(a) ikke-rearrangerte VH-gensegmenter,(b) den konstruerte DH-region, valgfritt hvor den konstruerte DH-region omfatter kun humane DH-gensegmenter; og(c) ikke-rearrangerte JH-gensegmenter,hvor (a)-(c) er i operabel kobling slik at, ved rekombinasjon, omfatter den variable region av den tunge immunglobulinkjede en rearrangert sekvens av den variable region av den tunge kjede, som koder for et variabelt domene av den tunge immunglobulinkjede, valgfritt hvor den rearrangerte sekvens av den variable region av den tunge kjede tildannes etter en VH(DH-DH)JH-rekombinasjonshendelse,valgfritt hvor:(aa) det konstruerte DH-gensegment omfatter et DH-segment umiddelbart naboliggende en 3' 23-mer-RSS;(bb) de konstruerte DH-gensegmenter omfatter et DH-gensegment umiddelbart naboliggende en 5' 23-mer RSS;(cc) den variable region av den tunge immunglobulinkjede er en human variabel region av den tunge immunglobulinkjede, omfattende kun humane VH-gensegmenter, humane DH-gensegmenter og humane JH-gensegmenter, valgfritt hvor den humane variable region av den tunge immunglobulinkjede er operabelt koblet til en CH-region, videre valgfritt hvor CH-regionen er en endogen CH-region, valgfritt på et endogent locus av den tunge immunglobulinkjede;(dd) de ikke-rearrangerte humane VH-gensegmenter omfatter det fullstendige repertoar av funksjonelle ikke-rearrangerte humane VH-gensegmenter, valgfritt hvor det fullstendige repertoar av funksjonelle ikke-rearrangerte humane VH-gensegmenter er i kimbanekonfigurasjon;(ee) de ikke-rearrangerte JH-gensegmenter omfatter et humant JH6-gensegment; og/eller(ff) (i) gnagergenomet mangler et endogent Adam6-gen; eller (ii) gnagergenomet videre omfatter ett eller flere gnager-Adam6-gener, valgfritt hvor:det ene eller de flere gnager-Adam6-gener omfatter et endogent gnager-Adam6-gen;det ene eller de flere gnager-Adam6-gener innsettes mellom to humane VH-gensegmenter, valgfritt hvor det ene eller de flere gnager-Adam6-gener innsettes mellom et ikke-rearrangert humant VH1-2-gensegment og et ikkerearrangert humant VH6-1-gensegmentdet ene eller de flere gnager-Adam6-gener innsettes i stedet for et humant Adam6-pseudogen; og/eller det ene eller de flere gnager-Adam6-gener innsettes mellom et ikkerearrangert humant VH-gensegment og et ikke-rearrangert humant DH-gensegment.16. Gnagergenom ifølge krav 14 eller 15, hvor:(a) gnagergenomet videre omfatter et terminalt deoksynukleotidyltransferasegen;(b) gnagergenomet er karakterisert ved at det er homozygot for den konstruerte DH-region eller gnagergenomet er karakterisert ved at det er heterozygot for den konstruerte DH-region; og/eller(c) gnagergenomet er et rottegenom eller et musgenom.17. Gnagercelle som omfatter gnagergenomet ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 16, valgfritt hvor gnagercellen er en rottecelle eller en musecelle.18. Gnagercelle ifølge krav 17, hvor gnagercellen er en embryonal gnagerstamcelle.19. Gnager, oppnådd fra den embryonale gnager-stamcelle ifølge krav 18, hvor gnageren omfatter gnagergenomet i sin kimbane.20. Gnager ifølge krav 19, hvor:(a) gnageren videre omfatter et somatisk genom som omfatter en kodingssekvens av en rearrangert tung kjede VH(DHA-DHB)JH, valgfritt hvor kodingssekvensen av den rearrangerte tunge kjede VH(DHA-DHB)JH er operabelt koblet til en gensekvens av en konstant IgM-region og/eller hvor DHA eller DHB er avledet fra det konstruerte DH-gensegment eller et avsnitt derav, og minst 9 basepar av DHA eller DHB er identisk med minst 9 basepar av det konstruerte DH-gensegment; og/eller(b) minst 95% av alle rearrangerte VDJ-kodingssekvenser av den tunge kjede i gnageren har en CDR3-lengde på minst 10 aminosyrer, valgfritt hvor minst 70% av alle rearrangerte VDJ-gensekvenser av den tunge kjede i gnageren har en CDR3-lengde på minst 11 aminosyrer, valgfritt hvor minst 15% av alle rearrangerte VDJ-gensekvenser av den tunge kjede i gnageren har en CDR3-lengde på minst 14 aminosyrer, videre valgfritt karakterisert ved at gnageren utviser minst en 3-foldig forhøyet frekvens av DH-DH-rekombinasjon sammenlignet med frekvensen av DH-DH-rekombinasjon i en referansegnager.21. Fremgangsmåte for fremstilling av en gnager, hvis genom omfatter en konstruert DH-region, idet fremgangsmåten omfatter:(A) å generere gnageren fra den embryonale stamcelle ifølge krav 18, eller (B)(a) å modifisere genomet av en embryonal gnager-stamcelle til å omfatte et DNA-fragment omfattende ett eller flere konstruerte DH-gensegmenter, idet hvert omfatter et DH-gensegment umiddelbart naboliggende en 23-mer-RSS, valgfritt hvor DNA-fragmentet omfatter nukleotidmolekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, målvektoren ifølge krav 9, den variable region av den tunge immunglobulinkjede, modifisert ifølge fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 10-12, eller den tunge immunglobulinkjede ifølge krav 13, og(b) å oppnå gnageren under anvendelse av den modifiserte embryonale gnager-stamcelle fra (B)(a).22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor gnageren er en rotte eller en mus.23. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff eller oppnåelse av en nukleinsyre som koder for samme, idet fremgangsmåten omfatterå immunisere en gnager med et antigen, hvilken gnager omfatter et kimbanegenom som omfatter en konstruert DH-region som omfatter ett eller flere konstruerte DH-gensegmenter som hvert er umiddelbart naboliggende en 23-mer-RSS, valgfritt hvor gnageren er gnageren ifølge et hvilket som helst av kravene 19 til 20 eller fremstilt ifølge krav 21, ogå tillate at gnageren danner en immunrespons på antigenet, innbefattende et antistoff, eller en nukleinsyre som koder for samme, som binder til antigenet, valgfritt hvor: (a) fremgangsmåten er en som videre omfatter å gjenvinne antistoffet eller nukleinsyren som koder for samme, fra gnageren eller en gnagercelle, hvor gnagercellen er en B-celle eller et hybridom;(b) ett eller flere konstruerte DH-gensegmenter som hvert er umiddelbart naboliggende en 23-mer-RSS, omfatter et DH-gensegment som er operabelt koblet til en 5' 23-mer-RSS;(c) ett eller flere konstruerte DH-gensegmenter som hvert er umiddelbart naboliggende en 23-mer-RSS, omfatter et DH-gensegment som er operabelt koblet til en 3' 23-mer-RSS; og/eller(d) gnageren er en rotte eller en mus.
