Krav
PATENTKRAV1. Genetisk modifisert gnager som omfatter i sin kimlinje ved et endogent immunglobulinlettkjedelokus et immunglobulinlettkjedelokus som omfatter en enkel omorganisert human immunglobulinlettkjedevariabel regiongensekvens avledet fra en omorganisert Vκ1-39/JK- eller Vκ3-20/JK-sekvens, hvori den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen er operativt forbundet til en immunglobulinlettkjedekonstant regiongensekvens, og hvori(i) den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen omfatter Vκ1-39/JK-gensekvensen som omfatter en erstatning av minst ett ikke-histidinkodon med et histidinkodon konstruert for å uttrykke et histidin(a) ved en posisjon valgt fra 105, 106, 108, 111 og en kombinasjon derav;(b) ved posisjonene 105, 106, 108 og 111; eller(c) ved posisjonene 106, 108 og 111; eller(ii) den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen omfatter Vκ3-20/JK som omfatter en erstatning av minst ett ikke-histidinkodon med et histidinkodon konstruert for å uttrykke et histidin(a) ved en posisjon valgt fra 105, 106, 107, 109 og en kombinasjon derav;(b) ved posisjonene 105, 106, 107 og 109; eller(c) ved posisjonene 105, 106 og 109;hvori posisjonene er i henhold til IMGT-nummerering.2. Gnageren ifølge krav 1, hvori:den immunglobulinlettkjedekonstante regiongensekvensen er en gnagerimmunglobulinlettkjedekonstant regiongensekvens, så som en endogen gnagerimmunglobulinlettkjedekonstant regiongensekvens.3. Gnageren ifølge ett av de foregående kravene, hvori: gnageren videre omfatter i sin kimlinje en ikke-omorganisert immunglobulintungkjedevariabel regiongensekvens som omfatter humane VH-, DH-og JH-segmenter, operativt forbundet til en immunglobulintungkjedekonstant regiongensekvens, eventuelt hvori den immunglobulintungkjedekonstante regiongensekvensen er en gnagerimmunglobulintungkjedekonstant regiongensekvens, så som en endogen gnagerimmunglobulinkonstant regiongensekvens, eventuelt ved et endogent gnagerimmunglobulintungkjedelokus.4. Gnageren ifølge ett av de foregående kravene, hvori gnageren mangler en funksjonell ikke-omorganisert immunglobulinlettkjedevariabel region.5. Gnageren ifølge ett av de foregående kravene, hvori den enkle, omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen er avledet fra en omorganisert VK1-39/JK5- eller VK3-20/JK1-gensekvens.6. Gnageren ifølge ett av de foregående kravene, hvori gnageren omfatter en populasjon av antigenspesifikke antistoffer, som sammenlignet med en populasjon av antigenspesifikke antistoffer generert i gnagere ikke omfatter et substituert histidinkodon i en immunglobulinlettkjedevariabel region, er beriket for antigenspesifikke antistoffer som utviser en reduksjon i dissosiativ halveringstid (t1/2) ved en sur pH sammenlignet med nøytral pH på minst ca. 2 ganger, minst ca. 3 ganger, minst ca. 4 ganger, minst ca. 5 ganger, minst ca.10 ganger, minst ca.15 ganger, minst ca. 20 ganger, minst ca. 25 ganger, minst ca. 30 ganger eller eventuelt ca.30 ganger eller mer.7. Gnageren ifølge ett av de foregående kravene, hvori gnageren uttrykker et antistoff som omfatter et humant immunglobulinlettkjedevariabelt domene med en substitusjon av minst én ikke-histidinrest med et histidin i en aminosyreposisjon kodet av det minst ene kodonet substituert i den immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen.8. Gnageren ifølge ett av de foregående kravene, hvori gnageren er en rotte.9. Gnageren ifølge ett av kravene 1-7, hvori gnageren er en mus.10. Gnageren ifølge ett av kravene 8-9, hvori den immunglobulinlettkjedekonstante regiongensekvensen er valgt fra en rotte- eller musimmunglobulinlettkjedekonstant regiongensekvens, eventuelt ved henholdsvis et endogent rottelettkjedelokus eller en endogen muselettkjedelokus; oghvori gnageren eventuelt videre omfatter i sin kimlinje en ikke-omorganisert immunglobulintungkjedevariabel regiongensekvens som omfatter humane VH-, DH-og JH-segmenter operativt forbundet til en immunglobulintungkjedekonstant regiongensekvens, valgt fra en rotte- eller en musetungkjedekonstant regiongensekvens; eventuelt ved henholdsvis et endogent rottetungkjedetunglokus eller ved et endogent museimmunglobulintungkjedelokus.11. Gnageren ifølge krav 10, hvori gnageren uttrykker en populasjon av antigenspesifikke antistoffer som respons på et antigen av interesse hvori alle antistoffer fra populasjonen omfatter:immunglobulinlettkjedevariable domener avledet fra den samme enkle omorganiserte humane lettkjedevariable regiongensekvensen som omfatter en substitusjon av minst ett ikke-histidinkodon med ett histidinkodon, ogimmunglobulintungkjeder som omfatter humane tungkjedevariable domener avledet fra et repertoar av humane tungkjede-V-, D- og J-segmenter.12. Fremgangsmåte for fremstilling av gnageren ifølge ett av de foregående kravene, hvori fremgangsmåten omfatter å erstatte alle funksjonelle immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvenser ved et endogent immunglobulinlettkjedelokus i gnageren med den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen, hvori den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen er operativt forbundet til en immunglobulinlettkjedekonstant regiongensekvens, så som en endogen gnagerlettkjedekonstant regiongensekvens i det endogene gnagerimmunglobulinlettkjedelokuset.13. Fremgangsmåte for generering av et antistoff som utviser pH-avhengig binding til et antigen av interesse, som omfatter:å immunisere en gnager ifølge ett av kravene 1 til 11, eller en gnager fremstilt av fremgangsmåten ifølge krav 12 med et antigen av interesse; ogå oppnå en B-celle som uttrykker et antistoff som binder til antigenet av interesse med en ønsket affinitet ved en nøytral pH, mens den viser redusert binding til antigenet av interesse ved en sur pH og eventuelt (a) ved hjelp av B-cellen for å fremstille et hybridom eller (b) å isolere DNA-et som koder for antistoffet fra B-cellen eller hybridomet og plassere DNA-et i ekspresjonsvektorer og transfektere vektorene til en vertscelle.14. Fremgangsmåten ifølge krav 13, hvori antistoffet utviser en dissosiativ halveringstid (t1/2) ved sur pH og 37 °C på ca.2 minutter eller mindre.15. Fremgangsmåten ifølge krav 13 eller 14, hvori fremgangsmåten er til fremstilling av et bispesifikt antistoff som utviser pH-avhengig binding til ett eller flere antigen(er).16. Fremgangsmåten ifølge krav 15, hvori fremgangsmåten omfatter:(a) å identifisere en B-celle som koder for et første tungkjedevariabelt domene som binder en første epitop av interesse og uttrykker et antistoff som utviser pH-avhengig antigenbinding og å isolere en første nukleinsyre som koder for den tungkjedevariable regionen; og(b) å identifisere en B-celle som koder for et andre tungkjedevariabelt domene som binder en andre epitop av interesse og uttrykker et antistoff som utviser pH-avhengig antigenbinding og å isolere en andre nukleinsyre som koder for den andre tungkjedevariable regionen;(c) å velge en tredje nukleinsyresekvens avledet fra den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regionsekvensen; og(d) å uttrykke de første, andre og tredje nukleinsyresekvensene for å danne det bispesifikke antistoffet.17. Gnagercelle isolert fra gnageren ifølge ett av kravene 1 til 11, eller isolert fra en gnager fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge krav 12, hvori cellen omfatter en enkel omorganisert human immunglobulinlettkjedevariabel regiongensekvens som er operativt forbundet til en immunglobulinlettkjedekonstant regiongensekvens og er avledet fra en omorganisert Vκ1-39/JK- eller Vκ3-20/Jκsekvens, og hvori(i) den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen omfatter Vκ1-39/JK-gensekvensen som omfatter en erstatning av minst ett ikke-histidinkodon med et histidinkodon konstruert for å uttrykke et histidin(a) ved en posisjon valgt fra 105, 106, 108, 111 og en kombinasjon derav(b) ved posisjonene 105, 106, 108 og 111; eller(c) ved posisjonene 106, 108 og 111; eller(ii) den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen omfatter Vκ3-20/Jκ som omfatter en erstatning av minst ett ikke-histidinkodon med et histidinkodon konstruert for å uttrykke et histidin(a) ved en posisjon valgt fra 105, 106, 107, 109 og en kombinasjon derav;(b) ved posisjonene 105, 106, 107 og 109 eller(c) ved posisjonene 105, 106 og 109;hvori posisjonene er i henhold til IMGT-nummerering.18. Gnagercellen ifølge krav 17, hvori cellen er en B-celle.19. Hybridom fremstilt fra en B-celle isolert fra gnageren ifølge ett av kravene 1 til 11, eller en gnager fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 12, hvori hybridomet omfatter et immunglobulinlettkjedelokus som omfatter en enkel omorganisert human immunglobulinlettkjedevariabelt regiongensekvens som er operativt bundet til en immunglobulinlettkjedekonstant regiongensekvens og er avledet fra en omorganisert Vκ1-39/JK- eller Vκ3-20/JK-sekvens, og hvori(i) den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen omfatter Vκ1-39/JK-gensekvensen som omfatter en erstatning av minst ett ikke-histidinkodon med et histidinkodon konstruert for å uttrykke et histidin(a) ved en posisjon valgt fra 105, 106, 108, 111 og en kombinasjon derav(b) ved posisjonene 105, 106, 108 og 111; eller(c) ved posisjonene 106, 108 og 111; eller (ii) den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen omfatter Vκ3-20/JK som omfatter en erstatning av minst ett ikke-histidinkodon med et histidinkodon konstruert for å uttrykke et histidin(a) ved en posisjon valgt fra 105, 106, 107, 109 og en kombinasjon derav;(b) ved posisjonene 105, 106, 107 og 109 eller(c) ved posisjonene 105, 106 og 109;hvori posisjonene er i henhold til IMGT-nummerering.20. Gnager-ES-celle som omfatter et immunglobulinlettkjedelokus som omfatter ved et endogent immunglobulinlettkjedelokus en enkelt omorganisert human immunglobulinlettkjedevariabel regiongensekvens operativt forbundet til en immunglobulinlettkjedekonstant regionsekvens og avledet fra en omorganisert Vκ1-39/JK- eller Vκ3-20/JK-sekvens, og hvori(i) den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen omfatter Vκ1-39/JK-gensekvensen som omfatter en erstatning av minst ett ikke-histidinkodon med et histidinkodon konstruert for å uttrykke et histidin(a) ved en posisjon valgt fra 105, 106, 108, 111 og en kombinasjon derav(b) ved posisjonene 105, 106, 108 og 111; eller(c) ved posisjonene 106, 108 og 111; eller(ii) den enkle omorganiserte humane immunglobulinlettkjedevariable regiongensekvensen omfatter Vκ3-20/JK som omfatter en erstatning av minst ett ikke-histidinkodon med et histidinkodon konstruert for å uttrykke et histidin(a) ved en posisjon valgt fra 105, 106, 107, 109 og en kombinasjon derav;(b) ved posisjonene 105, 106, 107 og 109 eller(c) ved posisjonene 105, 106 og 109;hvori posisjonene er i henhold til IMGT-nummerering.