Krav
Patentkrav1. Genetisk modifisert gnager, som i sin kimbane omfatter et immunglobulinlocus som omfatter en ikke-rearrangert human sekvens av en variabel immunglobulinregion, som er operativt forbundet med en sekvens av en konstant immunglobulinregion, hvor den ikke-rearrangerte humane sekvens av den variable immunglobulinregion omfatter en substitusjon av i det minste ett ikke-histidinkodon med et histidin-kodon eller en innsetting av i det minste ett histidin-kodon i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), hvor histidin-kodonet ikke kodes av et tilsvarende humant villtypekimbanegensegment.2. Gnager ifølge krav 1, hvor:(I) gnageren omfatter et første og et andre variabelt immunglobulinlocus, hvor i det minste det første eller det andre variable immunglobulinlocus omfatter en ikke-rearrangert human gensekvens av den variable immunglobulinregion, som omfatter innsettingen av i det minste ett histidinkodon eller substitusjonen av det i det minste ene ikke-histidin-kodon med det i det minste ene histidin-kodon; eller(II) innsettingen av et histidin-kodon er i CDR valgt blant en CDR1 av en tung kjede, en CDR2 av en tung kjede, en CDR3 av en tung kjede, en CDR1 av en lett kjede, en CDR2 av en lett kjede, en CDR3 av en lett kjede og en kombinasjon derav; eller(III) den ikke-rearrangerte humane gensekvens av den variable immunglobulinregion i det variable immunglobulinlocus omfatter et gruppering av 2, 3, 4 eller 5 histidiner som er substitusjoner av et histidinkodon for et ikke-histidin-kodon og/eller innsettinger av histidin-kodoner.3. Gnager ifølge krav 2(I), hvor både det første og det andre variable immunglobulinlocus hver omfatter en ikke-rearrangert human gensekvens av den variable immunglobulinregion, som omfatter substitusjonen av det i det minste ene ikke-histidin-kodon med det i det minste ene histidin-kodon eller innsettingen av det i det minste ene histidin-kodon. 4. Gnager ifølge krav 3, hvor:(I) det første variable immunglobulinlocus er et ikke-rearrangert humant variabelt locus av den tunge immunglobulinkjede (ikke-rearrangerte V-, D-, J-segmenter); eller(II) det andre variable immunglobulinlocus er et ikke-rearrangert humant locus av den lette immunglobulinkjede (ikke-rearrangerte V-, J-segmenter).5. Gnager ifølge krav 4 (I), hvor:(a) det ikke-rearrangerte humane variable locus av den tunge immunglobulinkjede omfatter ikke-rearrangerte humane V-, D- og J-segmenter;(b) det ikke-rearrangerte locus av den tunge immunglobulinkjede omfatter ikke-rearrangerte humane V-segmenter, et syntetisk D-segment som omfatter en linker, og et humant J-segment, valgfritt hvor det syntetiske D-segment omfatter i det minste ett histidin-kodon;(c) det andre variable immunglobulinlocus omfatter en rearrangert variabel gensekvens av den lette immunglobulinkjede (rearrangert VJ-sekvens); eller(d) det ikke-rearrangerte humane locus av den tunge immunglobulinkjede omfatter humane D-gensegmenter som ikke er invertert i forhold til orienteringsretningen av immunglobulinlocuset av den tunge kjede.6. Gnager ifølge krav 2(I), hvor i det minste ett av det første variable immunglobulinlocus eller det andre variable immunglobulinlocus er operativt forbundet med en endogen gnager-nukleinsyresekvens av den konstante region på et endogent gnager-immunglobulinlocus.7. Gnager ifølge krav 5(a), hvor ikke-rearrangerte humane V-, D-, J-segmenter er operativt forbundet med en endogen ikke-human nukleinsyresekvens av den konstante region av den tunge immunglobulinkjede, valgfritt operativt forbundet med den endogene gnager-nukleinsyresekvens av den konstante region av den tunge immunglobulinkjede på et endogent gnager-immunglobulinlocus. 8. Genetisk modifisert gnager, som omfatter en human ikke-rearrangert sekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede, som omfatter humane VH-, D- og JH-segmenter, hvor den humane ikke-rearrangerte sekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede er operativt forbundet med en gensekvens av den konstante region av den tunge immunglobulinkjede, hvor ett eller flere av de humane VH-, D- og JH-gensegmenter omfatter i det minste én substitusjon av et ikke-histidin-kodon med et histidin-kodon, og/eller i det minste én histidin-kodon-innsetting i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), hvor det substituerte eller innsatte histidin-kodon ikke kodes av et tilsvarende humant villtype-kimbanegensegment; ogen human ikke-rearrangert nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede som omfatter humane VL- og J-segmenter, hvor den humane ikke-rearrangerte nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede er operativt forbundet med en gensekvens av den konstante region av den lette immunglobulinkjede, hvor ett eller flere av VL- og JL-gensegmentene omfatter i det minste én substitusjon av et ikke-histidin-kodon med et histidin-kodon, og/eller i det minste én histidin-kodon-innsetting i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), hvor det substituerte eller innsatte histidin-kodon av den humane ikkerearrangerte nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede ikke kodes av et tilsvarende humant villtypekimbanegensegment.9. Genetisk modifisert gnager ifølge krav 8, hvor:(I) den humane ikke-rearrangerte nukleinsyresekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede er operativt forbundet med en gnager-nukleinsyresekvens av den konstante region av den tunge immunglobulinkjede, valgfritt hvor gnager-nukleinsyresekvensen av den konstante region av den tunge immunglobulinkjede som er operativt forbundet med den humane ikke-rearrangerte nukleinsyresekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede, er på et endogent gnager-immunglobulinlocus i gnagerens kimbane; og/eller(II) hvor gnager-nukleinsyresekvensen av den konstante region av den lette immunglobulinkjede, som er operativt forbundet med den humane ikkerearrangerte nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede, er på et endogent gnager-immunglobulinlocus i gnagerens kimbane.10. Genetisk modifisert gnager ifølge krav 8 eller krav 9, hvor den ikkerearrangerte nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede ikke omfatter mer enn to humane VL-gensegmenter, hvor hvert av de ikke mer enn to humane VL-gensegmenter omfatter en substitusjon av i det minste én ikke-histidinrest med en histidinrest.11. Genetisk modifisert gnager, som omfatter en human ikke-rearrangert sekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede, som omfatter humane ikke-rearrangerte VH-, D- og JH-segmenter, hvor den humane ikke-rearrangerte sekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede er operativt forbundet med en gensekvens av den konstante region av den tunge immunglobulinkjede, hvor ett eller flere av de humane ikke-rearrangerte VH-, D- og JH-gensegmenter omfatter i det minste én substitusjon av et ikke-histidin-kodon med et histidin-kodon eller i det minste én histidin-kodon-innsetting i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), hvor histidin-kodonet ikke kodes av et tilsvarende humant villtypekimbanegensegment; ogen enkelt rearrangert human VJ-nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede som omfatter humane VL- og JL-segmentsekvenser, hvor den enkelte rearrangerte humane nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede er operativt forbundet med en gensekvens av den konstante region av den lette immunglobulinkjede, hvor den rearrangerte VJ-sekvens omfatter i det minste én substitusjon av et ikke-histidin-kodon med et histidin-kodon eller i det minste én histidin-kodon-innsetting i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), hvor histidin-kodonet av den humane rearrangerte nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede ikke kodes av et tilsvarende humant villtype-kimbanegensegment.12. Genetisk modifisert gnager ifølge krav 11, hvor:(I) den humane ikke-rearrangerte nukleinsyresekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede er operativt forbundet med en gnager-nukleinsyresekvens av den konstante region av den tunge immunglobulinkjede, valgfritt hvor gnager-nukleinsyresekvensen av den konstante region av den tunge immunglobulinkjede, som er operativt forbundet med den humane ikke-rearrangerte nukleinsyresekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede, er på et endogent gnager-immunglobulinlocus i gnagerens kimbane og/eller(II) hvor gnager-sekvensen av den konstante region av den lette immunglobulinkjede, som er operativt forbundet med den humane rearrangerte nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede, er på et endogent gnager-immunglobulinlocus i gnagerens kimbane.13. Genetisk modifisert gnager, hvor dyret omfatter i sin kimbane i det minste én innsetting av et histidin-kodon eller i det minste én substitusjon av et ikke-histidinkodon med et histidin-kodon i en ikke-rearrangert gensekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede, som er operativt forbundet med et gen av den konstante region av den tunge kjede, på et immunglobulinlocus av den tunge kjede, hvor histidin-kodonet av immunglobulinlocuset av den tunge kjede er i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), og kodes ikke av et tilsvarende villtype-kimbanegensegment; ogi det minste én innsetting av et histidin-kodon eller i det minste én substitusjon av et ikke-histidin-kodon med et histidin-kodon i en ikke-rearrangert gensekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede som er operativt forbundet med et gen av den konstante region av den lette kjede på et immunglobulinlocus av den lette kjede, hvor histidin-kodonet av immunglobulinlocuset av den lette kjede er i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), og kodes ikke av et tilsvarende villtype-kimbanegensegment.14. Fremgangsmåte for tillaging av en gnager som danner variable antistoffdomener med histidiner som kodes av manipulerte histidin-kodoner, hvilken fremgangsmåte omfatter:å modifisere gnageren i dens kimbane, slik at den omfatter i det minste én substitusjon av et ikke-histidin-kodon for et histidin-kodon eller i det minste én innsetting av et histidin-kodon i en ikke-rearrangert human gensekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede, omfattende ikkerearrangerte humane VH-, D- og JH-segmenter, hvor histidin-kodonet er i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), og kodes ikke av et tilsvarende humant villtypekimbanegensegment; og/ellerå modifisere gnageren i dens kimbane, slik at den omfatter i det minste én substitusjon av et ikke-histidin-kodon for et histidin-kodon eller i det minste én innsetting av et histidin-kodon i en ikke-rearrangert human gensekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede, omfattende ikkerearrangerte humane VL- og JL-segmenter, hvor histidin-kodonet er i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), og kodes ikke av et tilsvarende humant villtypekimbanegensegment.15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvor fremgangsmåten omfatter:(I) genetisk modifisering av gnagerens kimbane slik at den omfatter en human ikke-rearrangert variabel sekvens av den tunge immunglobulinkjede, som omfatter humane VH-, D- og JH-segmenter, og gjennomføring av histidinsubstitusjonen eller -innsettingen i de ikke-rearrangerte humane VH-, D- og JH-segmenter; og/eller(II) genetisk å modifisere gnagerens kimbane slik at den omfatter en human ikke-rearrangert nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede, som omfatter VL- og JL-segmenter, og å gjennomføre histidinsubstitusjonen eller -innsettingen i den ikke-rearrangerte humane nukleinsyresekvens av den variable region av den lette immunglobulinkjede.16. Fremgangsmåte for tillaging av en gnager som danner variable antistoffdomener med histidiner som kodes av manipulerte histidin-kodoner, hvilken fremgangsmåte omfatter:å modifisere gnageren slik at den omfatter i det minste én substitusjon av et histidin-kodon for et ikke-histidin-kodon eller i det minste én innsetting av et histidin-kodon i en ikke-rearrangert gensekvens av den variable region av den tunge immunglobulinkjede av et ikke-rearrangert immunglobulinlocus av den tunge kjede, som omfatter ikke-rearrangerte VH-, D- og JH-segmenter,hvor histidin-kodonet er i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), og kodes ikke av et tilsvarende villtype-kimbanegensegment; ogå modifisere gnageren slik at den omfatter i det minste én substitusjon av et histidin-kodon for et ikke-histidin-kodon eller i det minste én innsetting av et histidin-kodon i en enkelt rearrangert variabel sekvens av den lette immunglobulinkjede, som omfatter rearrangerte VL- og JL-segmentsekvenser i kimbanen, hvor histidin-kodonet er i en nukleinsyresekvens som koder for en komplementaritetsbestemmende region (CDR), og kodes ikke av et tilsvarende villtype-kimbanegensegment.17. Gnager ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13 eller tillaget ved hjelp av fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 16, hvor gnageren velges blant en mus, en rotte og en hamster.18. Fremgangsmåte for generering av et antistoff som fremviser pH-avhengig binding til et antigen av interesse, idet fremgangsmåten omfatter immunisering av en gnager ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13 eller tillaget ved hjelp av fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 16 med et antigen av interesse, og å velge et antistoff som binder til antigenet av interesse ved en nøytral pH-verdi, idet det samtidig fremviser redusert binding til antigenet ved en sur pH-verdi.