Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av mellomprodukter som kan benyttes for semi-syntetisk fremstilling av taxol, Taxotére eller analoger derav fra forskjellige deler av planter inneholdende disse mellomprodukter.

Mer spesielt angår oppfinnelsen denne selektive fremstilling av 10-desacetyl-baccatin-III fra barken, stammen, røttene eller bladene av forskjellige specier av barlind.

Taxol og Taxotére samt deres analoger med den generelle formel:

og som manifesterer interessante anticancerøse og anti-leukemlske egenskaper, utgjør bemerkelsesverdige kjemo-terapeutiske midler for behandling av et visst antall cancere som for eksempel bryst-, prostata-, colon-, mave-, nyre-eller testikkelkreft og mer spesielt ovariekreft.

Fortrinnsvis kan i forbindelsen med den generelle formel (I) Ar bety en eventuelt substituert fenylrest, R bety et hydrogenatom eller en acetylrest eller en N-substituert karbamoylrest,

R' kan bety et hydrogenatom eller en N-substituert karbamoylrest og

R_^ kan bety en fenylrest eller en rest R₂-O-, der R₂ betyr en rest alkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, bicykloalkyl, fenyl eller heterocyklyl.

Taxol tilsvarer det produkt med den generelle formel (I) der Ar og Rj_l betyr en fenylrest, R betyr en acetylrest og R' betyr et hydrogenatom, og Taxotére tilsvarer den forbindelse med den generelle formel (I) der Ar betyr en fenylrest, R og R' betyr et hydrogenatom og R_^ betyr en t-butoksyrest.

Taxol som foreligger i naturlig tilstand i forskjellige specier av barlind der forbindelsene finnes i små mengder, er vanskelig å isolere uten å ty til total destruering av planten. For eksempel kan taxol isoleres i henhold til metoden ifølge C.H.O. Huang et al. som beskrevet i "J. Nati. Prod.", 49, 665 (1986) og som omfatter å behandle oppmalt bark fra Taxus brevifolia med metanol, og konsentrere ekstrakten, ekstrahere konsentratet med diklormetan, å konsentrere på ny, og dispergere resten i heksan:aceton i volumforholdet 1:1, og rense den oppløselige del ved kolonnekromatografi på en Florisil for å oppnå rå-taxol som så renses ved suksessive omkrystalliseringer i metanol:vann-og heksan:aceton-blandinger med sluttende kromatografi og ny krystallisering. Mengdene av taxol som ekstraheres på denne måte utgjør 0,005 til 0,017$ av plantedel som benyttes.

Taxotére som ikke eksisterer i naturlig tilstand, kan fremstilles ved hemi-syntese fra 10-desacetyl-baccatin-III med den generelle formel:

i henhold til prosesser som for eksempel er beskrevet i US 4 814 470 eller US 4 924 012, eller i den internasjonale søknad PCT W0 92/09589.

Taxol kan også fremstilles ved fremgangsmåter som anvender 10-desacetyl-baccatin-III, enten ved gjennomgang via Taxotére under betingelser som beskrevet i US 4 857 653, eller ved forestring av baccatin-III under de betingelser som er beskrevet i EP 400 971 eller EP 428 376, eller ved forestring av 10-desacetyl-baccatin-III og acetylering under de betingelser som er beskrevet i US 4 924 011.

De forskjellige varieteter av barlind (Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata, Taxus floridana, Taxus media og Taxus wallichiana) inneholder taxanderivatene av hvilke de prinsipale i det vesentlige er taxol og 10-desacetyl-baccatin-III, idet de andre derivater særlig er cefalomannin, 10-desacetyl-cefalomannin eller baccatin-III, eventuelt forbundet til sukkeret.

Mens taxol hovedsakelig finnes i stammen og barken, er 10—desacetyl-baccatin-III hovedsakelig til stede i bladene. Imidlertid er mengden av 10-desacetyl-baccatin-III i bladene generelt langt over den mengde taxol med hvilken denne forbindelse er til stede i bark, stamme eller blader.

Et resultat av dette er at det er særlig viktig å kunne disponere over 10-desacetyl-baccatin-III som er essensiell ved fremstilling mengder av taxol som er langt større enn ved direkte ekstrahering ut fra barlind samt ved fremstilling av Taxotére.

Ved å ekstrahere 10-desacetyl-baccatin-III fra blader av barlind er man ikke tvunget til total destruering av planten hvis blader kan benyttes på ny efter hver ny vekstcyklus.

Generelt nødvendiggjør de kjente metoder for ekstrahering av taxanderivater inneholdt i forskjellige deler av barlind (bark, stamme, røtter, blader ), anvendelse av kromatografiske teknikker er lange og kostbare og som ikke tillater noen total og kvantitativ separering av taxanderivatene som til å begynne med er til stede i planten.

10-desacetyl-baccatin-III kan oppnås, med utbytter nær 300 mg/kg blader (Taxus baccata), ved en fremgangsmåte som anvender masserering av nålene i etanol, en ekstrahering med et organisk oppløsningsmlddel som metylenklorid og suksessive kromatografier i henhold til den fremgangsmåte som er beskrevet i US 4 814 470.

De forskjellige bestanddeler som avledes fra taxan som er til stede i de forskjellige deler av barlind kan også separeres ved metoder som anvender "revers"-væskefasekromatografi som beskrevet særlig i den internasjonale søknad PCT V/0 92/07842. Disse prosesser omfatter i det vesentlige å behandle råekstraktene av barlind med kromatografi i "revers"-væskefase på et absorpsjonsmiddel der taxanderivatene fikseres, og så å eluere taxanderivatene og å isolere dem. I henhold til denne fremgangsmåte er det mulig å isolere 200 mg 10-desacetyl-baccatin-III fra 1 kg oppmalt og tørkede blader.

Det er nu funnet, og det er gjenstanden for foreliggende oppfinnelse, at 10-desacetyl-baccatin-III kan ekstraheres meget selektivt og med et utmerket utbytte, fra forskjellige deler av barlind og mer spesielt fra bladene, ved en enkel fremgangsmåte som ikke benytter kromatografiske teknikker. Det er således for eksempel mulig å ekstrahere ca. 800 mg 10-desacetyl-baccatin-III pr. kg barlinblader (Taxus baccata).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen består i å isolere 10-desacetyl-baccatin-III fra en vandig ekstrakt av barlindblader.

Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for foremstilling av 10-desacetyl-baccatin-III, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at man

1) behandler med 2 til 10 1 vann pr. kg, knuste deler som bark, stamme, røtter eller blader av barlind fra varie-teten Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata, Taxus floridana, Taxus media eller Taxus wallichiana ved en temperatur mellom 20 og 65"C, 2) separerer den vandige oppløsning inneholdende 10-desacetyl-baccatin-III fra den vegetabilske masse i suspensjon ved filtrering, sentrifugering eller dekantering, 3) ekstraherer 10-desacetyl-baccatin-III fra den vandige oppløsning hvis pH-verdi er under 7 ved hjelp av et organisk oppløsningsmlddel valgt blant alifatiske etere og estere som metyl-t-butyleter, etyl-t-butyleter, metyl-n-butyleter, metyl-n-amyleter, etyl-t-amyleter, t-butyl-isopropyleter, etyl-isobutyleter, t-butyl-n-propyleter, etyl-n-heksyleter, etylacetat, propylacetat, isopropylacetat, n-butylacetat, t-butylacetat, metyl-t-butylacetat, t-butylpropionat og t—amylacetat, 4) separerer den organiske ekstrakt inneholdende 10-desacetyl-baccatin-III fra den vandige fase ved dekantering, 5) fjerner oppløsningsmidlet fra den således separerte organiske ekstrakt ved destillasjon under redusert trykk, 6) krystalliserer selektivt 10-desacetyl-baccatin-III fra den således oppnådde rest i et organisk oppløsningsmlddel valgt blant alifatiske nitriler som acetonitril og propionitril, eventuelt i blanding med en alifatisk alkohol som metanol, etanol, propanol, isobutanol eller n-butanol eller en alifatisk ester som etyl-, isopropyl-, n-butyl- eller t-butylacetat eller et alifatisk keton som aceton, metyletylketon, metylpropylketon, metyl-n-butylketon og metylisobutylketon, og derefter 7) isolerer 10-desacetyl-baccatin-III i renset form ved filtrering, dekantering eller sentrifugering.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling av 10-desacetyl-baccatin-III, som karakteriseres ved at man: 1) behandler med 2 til 10 1 vann pr. kg knuste deler som bark, stamme, røtter eller blader av barlind fra varie-teten Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata, Taxus floridana, Taxus media eller Taxus wallichiana ved en temperatur mellom 20 og 65°C, 2) separerer den vandige oppløsning inneholdende 10-desacetyl-baccatin-III fra den vegetabilske masse i suspensjon ved filtrering, sentrifugering eller dekantering, 3) adsorberer ved perkolering på en harpiksbaerer, for eksempel polystyren-divinylbenzenharpiks, den vandige oppløsning inneholdende 10-desacetyl-baccatin-III, 4) desorberer 10-desacetyl-baccatin-III ved hjelp av et organisk oppløsningsmlddel valgt blant alifatiske C]_g-alkoholer, 5) eliminerer det organiske oppløsningsmlddel fra desorbatet ved destillasjon under redusert trykk, 6) krystalliserer selektivt 10-desacetyl-baccatin-III fra den således oppnådde rest i et organisk oppløsningsmlddel valgt blant alifatiske nitriler som acetonitril og propionitril, eventuelt i blanding med en alifatisk alkohol som metanol, etanol, propanol, isopropanol og n-butanol eller en alifatisk ester som etyl-, isopropyl-, n-butyl- og t-butylacetat eller et alifatisk keton som metyletylketon, metylpropylketon, metyl-n-butylketon og metyl-isobutylketon, og 7) isolerer 10-desacetyl-baccatin-III i renset form ved filtrering, dekantering eller sentrifugering.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres på en hvilken som helst egnet del av barlind som barken, stammen, røttene eller bladene. Barlinden som benyttes for gjennom-føring av fremgangsmåten er fortrinnsvis Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata, Taxus floridana, Taxus media eller Taxus wallichiana. Det er særlig fordelaktig å benytte blader av barlind (Taxus baccata, Taxus brevifolia) som generelt er langt rikere på 10-desacetyl-baccatin-III. De benyttede fragmenter kan ha dimensjoner fra 0,5 og opp til noen mm. Av bekvemmelighets-hensyn kan det være fordelaktig å benytte fragmenter hvis midlere dimensjoner er under 1 mm. De oppmalte deler, eventuelt også tørkede, av barlinden kan oppnås ved operasjoner omfattende oppmaling, og eventuelt tørking, som eventuelt går foran eller følger efter fryseteknikker og opptiningsteknikker av friske plantedeler, eller som går inn mellom frys-tiningsprosesser på de friske plantedeler.

Behandlingen med vann av de oppmalte deler av barlind gjennomføres i henhold til kjente teknikker. Særlig blir en vandig oppløsning inneholdende 10-desacetyl-baccatin-III generelt oppnådd ved omrøring, ved en temperatur mellom 20 °C og 65"C, av de oppmalte deler av barlind i vann i tidsrom fra 30 minutter til 2 timer. Mengden vann som benyttes kan variere innen vide grenser, imidlertid er det hensiktsmessig å benytte en vannmengde på 2 til 10 liter, beregnet pr. kg oppmalt og tørket plantedel, fortrinnsvis ca. 5 1 vann pr. kg plantedel som skal behandles. Det kan være fordelaktig å benytte demineralisert vann for å gjennomføre behandlingen, og å arbeide under ultralyd.

For å forbedre utbyttet, kan det være fordelaktig å gjennom-føre flere behandlinger med vann av den vegetabilske masse for å oppnå vandige oppløsninger fra hvilke man ekstraherer 10-desacetyl-baccatin-III under de nedenfor beskrevne betingelser.

Den oppnådde vandige oppløsning inneholdende 10-desacetyl-baccatin-III separeres fra den vegetabilske masse ved kjente teknikker som filtrering, sentrifugering eller dekantering. Den resulterende vandige oppløsning, eventuelt avkjølt, kan behandles i henhold til en av de følgende metoder: 1) 10-desacetyl-baccatin-III ekstraheres, en eller flere ganger, med et organisk oppløsningsmlddel. De organiske oppløsningsmidler som egner seg særlig bra velges blant etere som metyl-t-butyleter, etyl-t-butyleter, metyl-n-butyleter, metyl-n-amyleter, etyl-t-amyleter, t-butyl-isopropyleter, etyl-isobutyleter, t-butyl-n-propyleter eller etyl-n-heksyleter og alifatiske estere som etylacetat, propylacetat, isopropylacetat, n-butylacetat, t-butylacetat, metyl-t-butylacetat, t-butylpropionat eller t—amylacetat. Av helt spesielt interesse er metyl-t-butyleter, etyl-t-butyleter, etylacetat eller n-butylacetat .

Ekstrahering med et organisk oppløsningsmlddel gjennom-føres generelt i vandig oppløsning hvis pH-verdi er under 7 og fortrinnsvis under 6.

De organiske ekstrakter inneholdende 10-desacetyl-baccatin-III separeres fra den vandige fase ved anvendelse av vanlige teknikker som dekantering.

De organiske ekstrakter vaskes eventuelt ved hjelp av en svakt basisk vandig oppløsning (for eksempel en vandig natriumkarbonatoppløsning) og/eller med vann. Efter tørking blir det organiske oppløsningsmlddel fra ekstrakten fjernet i henhold til vanlige metoder og særlig ved destillasjon, eventuelt under redusert trykk, for derved å gi en generelt fast rest hvorfra man isolerer 10-desacetyl-baccatin-III ; 2) den vandige oppløsning adsorberes på en hensiktsmessig bærer for å fiksere 10-desacetyl-baccatin-III. Som bærer benyttes en adsorberende harpiks som fortrinnsvis velges blant polystyren-divinylbenzenharpikser.

Desorpsjonen av 10-desacetyl-baccatin-III skjer ved vasking av bæreren med et egnet oppløsningsmlddel. Som oppløsningsmlddel benyttes fortrinnsvis en alifatiske C₁_₃-alkohol og mer spesielt metanol.

Den organiske oppløsning separeres fra bæreren, generelt ved filtrering og konsentreres derefter til tørr tilstand, generelt ved destillasjon, eventuelt under redusert trykk, og man oppnår derved en generelt fast rest hvorfra man isolerer 10-desacetyl-baccatin-III.

Den selektive krystallisering av det urene 10-desacetyl-baccatin-III, oppnådd på den ene eller andre måte, gjennom-føres fra en oppløsning av resten, oppnådd i et organisk oppløsningsmlddel eller i en blanding av organiske oppløs-ningsmidler. Som oppløsningsmidler som tillater selektiv krystallisering av 10-desacetyl-baccatin-III kan med fordel benyttes nitriler som acetonitril, propionitril eller isobutyronitril, eventuelt i blanding med en alifatisk alkohol som metanol, etanol, propanol, isopropanol eller n-butanol, eller en alifatisk ester som etylacetat, isopropylacetat, n-butylacetat eller t—butylacetat, eller et alifatisk keton som aceton, metyletylketon, metylpropylketon, metyl-n-butylketon eller metylisobutylketon. Det er spesielt fordelaktig å gjennomføre den selektive krystallisering i acetonitril, eventuelt i nærvær av etanol og/eller etyl-eller n-butylacetat og/eller aceton.

Det 10-desacetyl-baccatin-III som precipiterer separeres ved filtrering, dekantering eller sentrifugering.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater å oppnå 10-desacetyl-baccatin-III i praktisk talt ren form og med utbytter som generelt ligger godt over det som oppnås ved gjennomføring av de tidligere kjente prosesser. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater på kvasikvantitativ måte å ekstrahere den totale mengde 10-desacetyl-baccatin-III i plantedelene som benyttes og særlig bladene.

Det 10-desacetyl-baccatin-III som oppnås ved ekstraherings-prosessen ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å fremstille taxol eller Taxotére eller deres derivater under betingelser som er beskrevet nærmere i EP 0 253 738, EP 0 253 739, EP 0 336 841, EP 0 336 840, V/0 92 09589, EP 0 400 971 og EP 0 428 376.

Oppfinnelsen skal illustreres nærmere under henvisning til de følgende eksempler.

Til 2,5 1 demineralisert vann, oppvarmet til 50°C, settes 500 g barlindblad (Taxus baccata) i oppmalt og tørket tilstand og hvis midlere partikkelstørrelse er under 1 mm og der innholdet av 10-desacetyl-baccatin-III, bestemt ved HPLC, er 0,08$, det vil si 400 mg 10-desacetyl-baccatin-III i 500 g blad. Man omrører i 1 time ved 50"C og filtrerer.

Filtratet på 1,8 1 og hvis pH-verdi er 5,4, ekstraheres med 3 x 0,9 1 etylacetat. De organiske faser forenes (2,7 1), vaskes 2 ganger med 1 1 av en 0,1M natriumkarbonatoppløsning og så med 2x11 demineralisert vann og tørkes til slutt over natriumsulfat. Efter filtrering og konsentrering til tørr tilstand oppnås 3,2 g av et fast stoff som tas opp i 9 cm⁵ acetonitril ved en temperatur nær 70°C. Efter avkjøling over natten ved en temperatur nær +40 C blir precipitatet separert ved filtrering. Man oppnår på denne måte, efter tørking, 2,45 mg krystaller som i henhold til HPLC-analyse inneholder 75$ 10-desacetyl-baccatin-III i ren form, det vil si 183 mg. Moderlutene inneholder, efter HPLC-analyse, 40 mg 10-desacetyl-baccatin-III.

Den vegetabilske masse som holder tilbake 0,7 1 vann, ekstraheres 2 ganger under de ovenfor beskrevne betingelser. De forenede, vandige filtrater behandles som ovenfor. Man oppnår på denne måte 2,5 g av et fast produkt som man tar opp i 5 cm⁵ acetonitril ved en temperatur nær 70°C. Efter avkjøling over natten ved en temperatur nær +4°C, separeres ved filtrering 169 mg krystaller som i henhold til HPLC inneholder 75$ rent 10-desacetyl-baccatin-III, det vil si 127 mg. Moderlutene inneholder i henhold til HPLC, 47 mg 10-desacetyl-baccatin-III .

Den totale mengde 10-desacetyl-baccatin-III som er ekstrahert med vann, er 183 + 40 + 127 + 47 = 397 mg.

Man oppvarmer 3 1 demineralisert vann til 50° C og tilsetter så 500 g knuste og tørkede barlindblader hvis midlere partikkeldiameter er ca. 1 mm og hvis innhold av 10-desacetyl-baccatin-III, bestemt ved HPLC, er 0,08$, det vil si 400 mg 10-desacetyl-baccatin-III i 500 g blader. Man omrører i 1 time ved 50° C og filtrerer. Filtratet på 1,97 1 og hvis pH-verdi er 5,15, justeres til pH lik 4,6 ved tilsetning av konsentrert saltsyre, hvorefter det hele filtreres på en membran av asbestpapp i et Seitz-filter. Man gjenvinner 1,8 1 filtrat.

Man ekstraherer 300 cm⁵ filtrat med 3 x 150 cm⁵ og så med 4 x 60 cm³ metyl-tert-butyleter, MTBE. De forenede ekstrakter konsentreres og gir 620 mg fast stoff som tas opp i 3 cm⁵ acetonitril ved 70"C.

Efter avkjøling over natten ved +4°C separerer man ved filtrering 28 mg 10-desacetyl-baccatin-III i krystallisert form og hvis renhet, bestemt ved HPLC, er 90$. Moderlutene inneholder 12,8 mg 10-desacetyl-baccatin-III, bestemt ved

Man knuser 1 kg nyklippede bariindblader (Taxus baccata) hvis vanninnhold er 69$ og hvis innhold av 10-desacetyl-baccatin-III er 651 mg/kg, bestemt ved HPLC, i en blander på 2 liter, i nærvær av demineralisert vann, ved 10 suksessive identiske operasjoner idet man hver gang anvender 100 g blad og 500 cm⁵ vann med en temperatur nær 20°C. Den oppnådde blanding filtreres over en bomullsduk og så på papir og man skyller med tilsammen 200 cm⁵ vann. Man gjenvinner 5000 cm⁵ filtrat, det vil si 84,9 volum-$ av den totale mengde vann (benyttet vann og vann fra bladene). I henhold til HPLC-bestemmelse inneholder den således oppnådde, vandige oppløsning 72 g tørrstoff hvorav 550 mg 10-desacetyl-baccatin-III, det vil si praktisk talt den teoretiske mengde på 552,7 mg (84,9$ av 651 mg). Resten av det 10-desacetyl-baccatin-III som er inneholdt i vannet i det vegetabilske materialet kan oppnås ved vasking av vannet fra det vegetabilske materialet.

Den vandige oppløsning på 5000 cm⁵ perkoleres på en kolonne med diameter 5 cm, fylt i en høyde på 10 cm med en polystyren-divinylbenzenharpiks (Amberchrom CG 161 med®

Harpiksen skylles med vann, tørkes og bringes i suspensjon i metanol.

Efter filtrering og konsentrering til tørr tilstand av filtratet oppnås en rest på 15,5 g som tas opp i 100 cm⁵ etylacetat. Ved filtrering separeres 8,7 g av et uoppløselig produkt og filtratet konsentreres til et volum på 5 cm3 . Man tilsetter 30 cm⁵ acetonitril. Man oppnår en uklar oppløsning i hvilket det meget hurtig opptrer hvite krystaller. Efter henstand over natten ved 4°C, blir de hvite krystaller separert ved filtrering og tørket. Man oppnår på denne måte 548 mg 10-desacetyl-baccatin-III, solvatisert med 1 mol acetonitril, i et utbytte på 92$.

HPLC-analyse med intern normalisering viser at krystallene inneholder 82$ 10-desacetyl-baccatin-III.

Utbyttet av 10-desacetyl-baccatin-III er således 75,4$.