COMPAS-PCR fremgangsmåte og fremgangsmåter for påvisning, identifisering eller overvåking av laksearter, kit, samt anvendelse av metoden og kit

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en asymmetrisk PCR-fremgangsmåte; COMplementary-Primer-Asymmetric (COMPAS)-PCR og spesifikk fremgangsmåte for å detektere, identifisere eller overvåke arter hos laksefisk samt et kit. Det beskrives oligonukleotidprimere tilsvarende artsspesifikke sekvenser. Bruken av fremgangsmåtene og kit er også et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen.

[ 1 ], har nukleinsyre (NA) amplifiseringsteknikker hatt en enestående påvirkning når det gjelder utviklingen av molekylærbiologiske anvendelser. En medvirkende faktor til denne suksessen er metodens fleksibilitet i forhold til endringer, dette utvider de tekniske mulighetene til PCR. Det er utviklet flere metoder spesielt for påvisning av punktmutasjoner som «Amplification Refractory Mutation System» (ARMS) [ 2 ] og varianter som PCR «Amplification of Specific Allels» (PASA)

[3,4], toveis - Pasa [ 5 ] eller Mistmatch Amplifiserings mutasjonstest (MAMA) [ 6 ], Taq - MAMA [ 7 ] og Melt - MAMA [ 8 ]. Punktmutasjoner også kalt enkel nukleotid polymorfisme (SNP), utgjør differensierende genetisk informasjon som kan være relevant i ulike sammenhenger som f.eks. medisinsk bruk for sykdomsdiagnostikk, populasjonsgenetikk og artsidentifisering. Ettersom mengden av PCR applikasjoner øker kan begrensningene som ligger i DNAets kjemi bli mer utfordrende. For eksempel kan primer komplementaritet som fører til "primer-dimers" dannelse være en begrensende faktor for utformingen av generisk PCR.

Det antas at den asymmetriske PCR-metoden i henhold til den foreliggende oppfinnelse vil utbedre begrensningene som ligger i PCR metoden som følge av primer komplementaritets-inkompatibilitet. Nevnte metode ble ytterligere anvendt i utviklingen av en PCR-analyse for direkte repeterte sekvenser.

NA-teknologien kan karakteriseres som ikke-invasiv, da svært lite materiale er nødvendig for å skaffe tilstrekkelig NA for analyse. Oppdrettsnæringen har behov for slike ikke-invasive fremgangsmåter for identifisering av art og kjønn hos laksefisk og særlig Salmo salar (atlantisk laks) og Salmo trutta (ørret) og deres hybrider. Metoder for bestemmelse av arter og inter-art hybridisering mellom ulike laksefiskearter er et viktig verktøy i økologiske studier, og ved vurdering av virkningen som rømlinger fra oppdrettsanlegg har på populasjonen av vill laksefisk. Økologiske studier har vist at inter-art hybridisering kan ha sterk påvirkning på populasjonens

Morfologisk diskriminering mellom hybrider og foreldrearter er i mange tilfeller vanskelig (f.eks. S. salar X S. trutta), adferden til hybridene også kan være forskjellig fra adferden til foreldreartene [9].

Genetisk kjønnsbestemmelse uten terminal prøvetaking (dvs. ved å drepe fisken) er et verdifullt verktøy i økologiske studier som benytter telemetri. Forskjell i kjønnsatferd hos fisk er ofte en oversett parameter ved vurdering av populasjonens sårbarhet i forhold til miljøforstyrrelser, dvs. i anadrom ørret ( Salmo trutta), er det en markert kjønnsskjevhet i "anadromity", som gjør hunnene (dvs. den økologisk relevante reproduktive delen av populasjonen) mer utsatt for marine miljøfaktorer enn hannene.

Det er også et stort kommersielt potensial for genetisk kjønnsbestemmelse i akvakultur næringen. De avisselskap som leverer rogn fra utvalgte stammer er i dag avhengige av ultralyd-kjønnsbestemmelse når fisken er 1-2 kg. Denne fremgangsmåten er arbeidskrevende og kostbar. Genetisk kjønnsbestemmelse på et tidlig stadium vil gjøre det mulig for selskapene å redusere produksjonskostnadene for hunner ved tidlig eliminering av hanner, og dermed eliminere den medfølgende kostnaden.

Identifisering av fiskearter ved PCR, er tidligere undersøkt og flere løsninger har vært foreslått. Ved valg av tilgjengelige metoder for identifisering av laks og ørret som f.eks. i referansene [ 10-14 ], fremgangsmåten publisert av AM Pendas et al. (Chromosomal 20 mapping and nucleotide sequence of two tandem repeats of Atlantic salmon 5 S rDNA Cytogenet Cell genet 67:31-36 (1994)) [14] synes å gi det beste resultatet blant de testede metodene. Overraskende oppdaget oppfinneren at fremgangsmåten ikke var pålitelig for det ovennevnte formål for identifikasjon av artene Salmo salar og Salmo trutta, da artene ikke differensierte seg fra hverandre på en tilfredsstillende måte ved bruk av PCR metoden og primere som er beskrevet i [14]. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer derfor en robust og enkel PCR-metode som er i stand til spesifikt å identifisere Salmo salar og å skille mellom Salmo Salar, Salmo trutta og deres hybrider.

Oppfinneren testet Salmo-A & B PCR metoden utviklet av AM Pendas et al.; primerne var opprinnelig designet basert på 5S rDNA sekvens av regnbueørret ( Salmo gairdnerii, omdøpt Oncorhynchus mykiss) [ 15 ] og brukt på Salmo trutta og Salmo salar i tillegg til andre fiskearter [ 16 ]. Disse primere amplifiserer 118bp av 120bp kodede sekvensen for 5S rDNA sammen med den tilknyttede variable ikke-kodede sekvensen. Det amplifiserte produktet(ene) varierte i lengde, og ble brukt å skille nære arter. To "loci" ble opprinnelig funnet å være amplifisert for Salmo salar, ett stor produkt på om lag 255bp og et mindre produkt på rundt 525bp. Disse resultater er bekreftet av de 2 publiserte sekvensene for Salmo salar gb S73107.1 & gb S73106.1. Tilsvarende viste også Salmo trutta et dobbel-båndmønster, men med lengre produkter både for store og små "loci" [ 14 ].

store "loci" på rundt 255bp og henholdsvis lenger [ 16 ]. Ingen forskjeller i produktene mellom Salmo salar og for Salmo trutta ble detektert ved hjelp av fremgangsmåten utviklet av AM Pendas et al., da denne metoden ble testet av oppfinneren for å differensiere Salmo salarfra Salmo trutta og deres hybrider. Det genetiske målet for nevnte PCR metode, 5S - rDNA, ble brukt til å utvikle en ny og innovativ fremgangsmåte samt spesifikke oligonukleotid-primere for den foreliggende oppfinnelsen.

Det meste av arbeidet som er utført for å identifisere kjønnsassosierte genetiske markører hos laksefisk har brukt regnbueørret eller Chinook laks som modellorganismer [ 17-25 ]. Flere av disse målsekvensene ble testet av oppfinneren på Salmo salar i et forsøk på å skille hunner fra hanner ved PCR, men uten å lykkes.

ørret [ 26 ]. Primerne beskrevet av Yano et al. ble deretter anvendt av oppfinneren for å videreutvikle en spesiell PCR-metode som var i stand til å identifisere kjønn hos Salmo salar og Salmo trutta. Det beskrives her en test for identifisering av kjønn hos laksefisk, fortrinnsvis i Salmo salar og Salmo trutta [ 27 ]. Det er videre antatt at både identifikasjon av kjønn og identifisering av art slik det er beskrevet ovenfor vil være mulig å oppnå i en enkelt test.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte, kjennetegnet ved asymmetrisk PCR som omfatter å:

- utføre en polymerase kjedereaksjon, ved å utnytte svært eller delvis komplementære primere med henvisning til primere som er komplementære til hverandre og som under tidligere kjente betingelser vil binde til hverandre, og som konsekvens konkurrere med målsekvensbinding, der enten fremover- eller revers primerkonsentrasjonen reduseres for å oppheve blokkeringen av PCR-reaksjonen, ved først å fremme lineær amplifisering som gradvis vil skifte mot eksponentiell amplifisering ved COMplementary-Primer-ASymmetric (COMPAS)-PCR,

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for påvisning, identifisering eller overvåking av laksearter, kjennetegnet ved at den omfatter å: - tilveiebringe en nukleinsyreprøve fra laksefisk til bruk som mål-templat(er); - utføre en polymerase kjedereaksjon (PCR) ved å anvende COMplementary-Primer-ASymetric (COMPAS)-PCR i følge et hvilket som helst av kravene 1-4, for å amplifisere en nukleinsyremålsekvens fra templaten(e), ved å benytte et sett av svært komplementære primerpar i stand til å prime nevnte mål; - identifisere den amplifiserte nukleotid-målsekvensen(e);

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også kit for å detektere og identifisere laksearter, kjennetegnet ved at det omfatter en samling av oligonuklotideprimerpar valgt fra tabellene 1 og 2 eller komplementære sekvenser derav, som i stand til å detektere laksearter ved fremgangsmåten i følge et hvilket som helst av kravene 1-13.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av fremgangsmåtene i følge et hvilket som helst av kravene 1-13.

Det beskrives her oligonukleotidprimere, valgt fra oligonukleotidene fra Tabell 1 eller 2, eller en hvilken som helst kombinasjon derav, eller oligonukleotider med komplementære sekvenser eller funksjonelle tilsvarende sekvenser.

- tilveiebringe en nukleinsyreprøve fra laksefisk for å anvendes som (en) mål templat(er); - utføre en to-trinns tosidig sanntid polymerase kjedereaksjon (qPCR), for å amplifisere en nukleinsyre målsekvens av templaten(e), ved å benytte et sett eller flere sett av primerpar valgt fra Tabell 3, - identifisere den amplifiserte nukleotid-målsekvensen(e);

Beskrevet er også en fremgangsmåte for påvisning og identifisering av laksearter og/eller kjønn som omfatter fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 1-17, og "High Resolution

Melt analysis", der primersettene er valgt fra Tabellene 1, 2 og/eller 3, eller komplementære sekvenser derav, i en hvilken som helst kombinasjon

Videre er det beskrevet et sett for påvisning og identifikasjon av laksearter og/eller kjønn som består av en samling av primere valgt fra Tabellene 1, 2 og/eller 3, eller komplementære sekvenser derav, i en hvilken som helst kombinasjon som er i stand til å detektere laksearter og/eller kjønn ved fremgangsmåten beskrevet heri.

Det beskrives også anvendelse av fremgangsmåtene eller oligonukleotidprimeme, eller anvendelsen av settene.

Foretrukne utførelsesformer er angitt i patentkravene og i den detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen.

Figur 1. Illustrerer COMPAS - PCR optimaliseringseksempel for Salmo salar og Salmo trutta med varierende konsentrasjoner av fremover primer 5SNTS - 23F 0,6 til 0,05 \ i M mens en benytter en konstant konsentrasjon på 0,6 \ i M for den revers primeren 5SNTS - 22R+2. Figur 2. Illustrerer et forenklet diagram av den direkte gjentatte sekvens COMPAS -PCR, spesielt anvendt ved metoden for identifisering av arter. Figur 3. Illustrerer et detaljert diagram av metoden for identifisering av arter. Alle testede primere er vist med piler. " Salmo salar spesifikk" viser den bestemte reverse primeren med tre nukleotider "overheng" i NTS-delen. Figur 4. Illustrerer spesifikk amplifiseringsdifferensiering mellom Salmo salar og Salmo trutta, ved bruk av en revers primer med en ekstra nukleotid i 3 ' sammenlignet med Fig. 3: 5SNTS-23R+3. Fremover og reverse primerkonsentrasjoner er som beskrevet i figur 3. Figur 5. Illustrerer amplifiseringskurver for tosidig qPCR utført på S. salar, S. trutta og hybrider for å skille hanner fra hunner basert på SDY deteksjon. 18S brukes som en 20 positiv kontroll. Figur 6. Illustrerer smeltekurveanalyse for "duplex" qPCR utført på S. salar, S. trutta og hybrider, for å skille hanner fra hunner basert på SDY deteksjon. 18S brukes som en positiv kontroll. Figur 7. Illustrerer identifisering av arter metodeprimere. Primerpar 5SNTS23F + 5SNTS23R+3 er indikert med pilene. Merk: Alle reverse primere er vist som sine reverse komplement. Figur 8. Illustrerer resultatene for identifisering av art med fremgangsmåten som beskrevet i eksempel 2.

Det er et mål for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en asymmetrisk PCR-metode og ikke-invasive metoder for identifisering av arter blant laksefisk, fortrinnsvis Salmo salar og Salmo trutta og deres hybrider ved å bruke nesten komplementære primere rettet mot direkte tandem repetisjoner. Det er også beskrevet oligonukleotid primere som tilsvarer artsspesifikke sekvenser eller Singel Nukleotid Polymorfisme (SNP). Anvendelsen av fremgangsmåten og primerne er også et aspekt av foreliggende oppfinnelse, sammen med et sett omfattende nevnte primere. For å frigjøre komplementære primere fra hverandre for amplifikasjon av målproduktet, ble asymmetrisk PCR metoden utviklet ved å minske enten fremover eller revers primerkonsentrasjon inntil optimal PCR amplifikasjon er nådd. Som vist i figur 1, har denne progressivt generert sterk og lik amplifisering (ikke spesifikke) for både S. salar og S. trutta siden fremover primer konsentrasjonen ble redusert. Asymmetriske PCR- er tidligere beskrevet for å øke probebasert deteksjon hvor PCR vil skifte fra eksponentielt til lineær amplifisering for å favorisere probehybridisering til sin enkelt trådet mål sekvens, en metode som kalles "Linear-After-The-Exponential" (LATE)-PCR [28, 29]. I den foreliggende oppfinnelsen hvor primerne som brukes er svært komplementære vil den asymmetriske PCR ha et motsatt mønster skiftende fra lineær til eksponentiell amplifisering som effektivt fjerner amplifiseringshemming som ellers observeres med komplementære primere (se Fig. 1).

I løpet av de første amplifiseringsrundene vil den konsentrasjonsbegrensede primeren hovedsakelig bli blokkert av den overskytende primeren slik at lineær amplifisering finner sted. Lineært produkt akkumuleres, målsekvenskonsentrasjonen for de begrensende primerne øker, konsentrasjonen av de blokkerende komplementære primerne synker, derfor styrkes målpriming og påfølgende eksponentiell amplifisering. Vi betegner denne PCR-metoden som COMplementary-Primer-ASymetric (COMPAS)-PCR. De angitte laksefiskeksemplene (eksemplene 2 og 4) bruker komplementær primere som også har den samme målsekvensen, men det er forutsatt at fremgangsmåten kan anvendes på dels komplementære primere som har distinkte målsekvenser.

For å identifisere nukleotidsekvenser som er egnet som et mål for å skille mellom artene gjorde oppfinneren en strukturell studie av 5S-rDNA tandem direkte repetisjoner og la merke til at enhver del av tandem direkte repetisjon som dekker en lengde typisk for primerne (dvs. 20bp) ville være hensiktsmessig for å utforme komplementære primere som strukturelt dekker ett eller flere produkter avhengig av antall tandem direkte repetisjoner (se Fig. 2). Det er allment kjent innen fagfeltet at når primerne er designet med hensyn på ikke tandem direkte repetert DNA, vil komplementære primere amplifisere i motsatt retning, og unnlate å definere og amplifisere et produkt. I tillegg vil komplementære primerpar binde til hverandre og konkurrere med målbindingen og derfor sterkt hemme målamplifiseringen.

For å favorisere priming av mål DNA kontra priming til revers primer økte opp finneren fremover 3' primerenden av fremover primer med to nukleotider som tilfeldigvis var GG (sterk priming). Tilsvarende ble 3' enden av den reverse primeren forlenget for å favorisere priming til målet kontra priming til den fremover primeren.

Tilstedeværelsen av genetiske variasjoner og dets utnyttelse er nøkkelen til å utvikle en spesifikk test. Siden de publiserte sekvensene ikke ga hensiktsmessig informasjon om genetisk variasjon for S. salar og S. trutta, testet oppfinneren systematisk ut reverse primere ved å trinnvis øke med 1 nukleotid ved 3'ende. Dermed kunne oppfinneren utforske muligheten én etter én for SNP. Som grunnlag for testingen ble den reverse primeren valgt, da denne primeren var forlenget i den ikke transkriberte sekvensen (NTS), hvor det er mer utsatt for variasjoner enn i den kodende sekvensen der fremover-sekvensen ble utvidet (Fig. 2 og 3). Etter denne modus operandi observerte oppfinneren at ved å utvide den reverse primeren i 3' ende med 3 nukleotider inn i NTS, produserte analysen markert spesifisitet med sterk S. salar amplifisering og meget svak S. trutta amplifisering (se fig. 4). Denne spesifisitet ble bevart når 5' enden ble forkortet eller forlenget og ved og holde det spesifikke 3' "ankeret" uforandret (Fig. 3). Den observerte rest amplifisering for S. trutta ble ytterligere eliminert ved å øke PCR stringens (høyere "annealing" temperatur, kortere amplifiseringstid og to trinns i stedet fortre trinns PCR). Ved å bruke denne fremgangsmåten har oppfinneren utviklet en robust metode og løst problemet med å skille mellom laksearter, fortrinnsvis Salmo salar og Salmo trutta og deres hybrider, ved hjelp av den asymmetrisk PCR-metoden i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, og ved bruk av nesten komplementære primere som målsøker 5S rDNA tandem direkte repetisjoner. Oppfinneren har ved hjelp av komplementære primere også overvunnet en teknisk fordom innen teknikkens stand (Referanse: [ 30, 31]), da det er vist ved foreliggende oppfinnelse at komplementære primere kan anvendes som et verdifullt verktøy ved anvendelse av COMPAS-PCR-metoden i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

Metoden er ikke begrenset til identifisering av fiskearter. Å bruke nesten fullt komplementære primere rettet mot samme sekvensen kan også være aktuelt for en hvilken som helst organisme med direkte repeterte tandem DNA motiver av interesse som målsekvenser. For eksempel finnes 5S r-DNA tandem direkte repetisjonene i hovedsak i alle eukaryote celler [32, 33], og kan derfor ytterligere brukes til å utvikle konkrete komplementære - primer analyser for andre "taxon" og arter enn laksefisk. Videre vil metoden være nyttig for å utvikle analyser som bruker primere rettet mot forskjellige sekvenser, men som genererer primer - dimer grunnet delkomplementa ritet.

En metode for identifisering av kjønn i laksefisk er beskrevet heri ved å bruke en kjønns "duplex" qPCR på prøver fra laksefisk fortrinnsvis på Salmo salar og Salmo trutta og hybrider og primere beskrevet i Yano, A. et al [26].

Metoden til Yano, A. et al. [ 26 ] anvendte en vanlig PCR -metode og resultatet ble vist på en gel. Metoden ble utviklet og testet på regnbueørret, oncorhynchus mykiss. Det er imidlertid også behov for kjønnsdifferensiering for andre laksefiskearter som for S. salar og S. trutta, så vel som for utvikling av en raskere, enklere og mer pålitelig test.

Videre er metoden forbedret ved å anvende sanntid PCR med en smeltekurveanalyse ved hjelp av parametre mer stringente enn det som vanligvis benyttes (dvs. 0,2 °C trinn i stedet for 0,5 °C for smeltekurven). Fremgangsmåten gjør det mulig å vise og klart skille de to toppene (som indikerer to produkter, dvs. hankjønn- og hunkjønnprofiler, se figur 6). Når 0,5 °C intervaller brukes, er det ikke mulig å se de to toppene, og kjønn kan ikke identifiseres direkte av qPCR. Fremgangsmåten ved Yano, A. et al. [26], benytter en "annealing" temperatur på 60 °C med en 3 trinns-amplifikasjonsprotokoll med varighet på totalt 90s (30 + 30 +30). "Annealing" temperaturen kan være i området fra 60 °C til 65 °C, og kan være 62 °C, mer foretrukket 63 °C, mest foretrukket 64 °C, og amplifisering kan være en 2- trinns amplifisering protokoll som fortrinnsvis varer i 20s totalt (5 + 15). Tidsspenn på 10, 15, 25 og 30 sekunder kan også anvendes. Dette gjør det mulig å kjøre amplifiseringen og smeltekurvenene i omtrent 1 time og vil gi resultater uten å kreve noen ekstra arbeid dvs. kjøre en gel.

Følgelig vil et første aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrøre en fremgangsmåte for asymmetrisk PCR som omfatter å:

- utføre en polymerase kjedereaksjon, ved å utnytte svært eller delvis komplementære primere med henvisning til primere som er komplementære til hverandre og som under tidligere kjente betingelser vil binde til hverandre, og som konsekvens konkurrere med målsekvensbinding, der enten fremover- eller revers primerkonsentrasjonen reduseres for å oppheve blokkeringen av PCR-reaksjonen, ved først å fremme lineær amplifisering som gradvis vil skifte mot eksponentiell amplifisering ved COMplementary-Primer-ASymmetric (COMPAS)-PCR,

I en utførelsesform kan de svært komplementære primerne ha en felles overlappende DNA målsekvens eller en forskjellig DNA målsekvens.

I en ytterligere utførelsesform kan den overlappende DNA målsekvensen omfatte direkte tandem repetisjoner. I en ytterligere utførelsesform kan de direkte tandem repetisjonene være i 5S-rDNA regionen. Andre regioner kan imidlertid også være et alternativ.

I en ytterligere utførelsesform kan bestemmelse av PCR spesifisiteten foretas ved en smeltekurveanalyse av PCR produktet, dette kan også gjøres ved elektroforeseanalyse.

Som benyttet her refererer komplementære primere seg til primere som er komplementære med hverandre og vil under tidligere kjente betingelser binde seg til hverandre for å danne primer-dimer.

Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for påvisning, identifisering eller overvåking av laksearter omfattende å: - tilveiebringe en nukleinsyreprøve fra laksefisk til bruk som måltemplat(er); - utføre en polymerase kjedereaksjon (PCR) COMplementary-Primer-ASymetric (COMPAS)-PCR i følge oppfinnelsen, for å amplifisere en nukleinsyremålsekvens fra templaten(e), ved å benytte et sett eller flere sett av svært komplementære primerpar i stand til å prime nevnte mål; - identifisere den amplifiserte nukleotid-målsekvensen(e);

Som benyttet her referer laksefisk ("salmonid") seg til en familie av strålefinnede-fisk («ray-finned fish»), som inkluderer laks, ørret, røye, hvite ferskvannsfisk og harr. Den atlantiske laksen og ørreten av slekten Salmo gir navn til familien og ordenen.

I en ytterligere utførelsesform kan bestemmelsen av arten utføres av en smeltekurveanalyse av PCR- produktet, eller ved hjelp av elektroforese-analyse. Andre metoder for bestemmelse av PCR-produktet kan også brukes.

I én eller flere utførelsesformer kan fremover primeren forlenges i 3'-ende for å favorisere priming til målet og ikke til den reverse primeren. Den reverse primeren kan forlenges i 3'-enden for å favorisere priming til målet og ikke til fremover primeren. Den reverse eller fremover primeren kan ha en SNP i sin 3' ende. Nevnte primer kan også gli ut til "høyre" i den 5S - rDNA kodede sekvens, ut av det komplementære området med den reverse primeren. Videre kan den reverse primeren forlenges i 5' ende. 3' fremover primer kan forlenges med 4, fortrinnsvis med 3, mer foretrukket med 2 nukleotider.

I en ytterligere utførelsesform kan primerne i primerparet være oligonukleotider med en lengde på omtrent 12 til omtrent 30, fortrinnsvis omtrent 20 bp.

I en ytterligere utførelsesform kan det komplementære settet av primere som blir valgt fra et sett av primer par(ene), der fremover primeren kan velges fra Tabell 1, eller en komplementær sekvens derav og den reverse primeren kan velges fra Tabell 2, eller en komplementær sekvens derav, eller en hvilken som helst kombinasjon derav.

Den revers primeren kan låses i sin 3' ende ved «+3» i den ikke-kodende sekvensen, ute av det komplementære fremre primer-området, på grunn av at spesifisiteten ligger i nøyaktig posisjonering av denne SNP. I den andre enden, i 5' ende, kan den reverse primeren være kortere eller lengre (avhengig av den fremre primeren).

I en utførelsesform av den foreliggende fremgangsmåten kan laksefisken være av arten Salmo trutta, Salmo salar og hybrider av disse. Fremgangsmåten kan imidlertid anvendes på andre laksefiske-arter, andre fiskearter eller en hvilken som helst organisme med tandem repeterte DNA motiver.

I et tredje aspekt av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringes et kit for påvisning og identifisering av laksearter og hybrider av disse som omfatter en samling av oligonukleotid-primere valgt fra Tabellene 1 og 2, i en hvilken som helst kombinasjon, eller komplementære sekvenser derav i stand til å detektere laksearter ved hvilken som helst av fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse.

I videre aspekter omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse. Omfattet er også bruk av kittet tilveiebrakt i følge foreliggende oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelsen er nå fullstendig beskrevet i detalj ved hjelp av illustrasjoner og eksempel med det formål å skape forståelse, det vil være åpenbart for en fagmann at oppfinnelsen kan utføres ved å modifisere eller endre oppfinnelsen ved hjelp av et bredt og ekvivalent spekter av tilstander og andre parametere, og at slike modifikasjoner eller endringer er ment å omfattes av omfanget av de vedlagte kravene.

Prøvene ble oppbevart i 98 % EtOH før DNA-ekstraksjon ble utført ved hjelp av mekaniske eller kjemiske metoder for å frigi DNA for PCR. Etterfølgende DNA måling ble utført ved hjelp av et Nanodrop instrument (Thermo Scientific) og alle prøvene ble fortynnet i vann for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 4 ng Prøver (2.5jxl) ble amplifisert i 25 endelige reaksjonsblandinger ved bruk av en ABI 7500 qPCR maskin (Life technologies, Applied Biosystems). Blandingen inneholdt 12.5 _^l MESA Blue qPCR MasterMix (Eurogentec), 0.6 _^M revers primer 5SNTS-23R+3, fremover primer 5SNTS-23F konsentrasjon ble suksessivt testet med: 0.6, 0.4, 0.2, 0.1 og 0.05 \ M, reaksjonen ble utført med destillert vann, med et sluttvolum på 25 y>\. Tre-trinns PCR-betingelsene besto av 5 min aktivering ved 95 °C etterfulgt av 30 sykluser til 95 °C i 20 s, 62 °C i 30 s og 72 °C i 60 sek. Sanntidsamplifiserings-kurvene er vist i Fig1.

Prøvene ble oppbevart i 98 % EtOH før DNA-ekstraksjon ble utført ved hjelp av mekaniske eller kjemiske metoder for å frigi DNA for PCR. Etterfølgende DNA måling ble utført ved hjelp av en Nanodrop instrumentet (Thermo Scientific) og alle prøvene ble fortynnet i vann for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 4 ng/_^l. Prøver (2.5 _^l) ble amplifisert i 25 endelige reaksjonsblandinger ved bruk av en ABI 7500 qPCR maskin (Life technologies, Applied Biosystems). Blandingen inneholdt 12.5 _^l MESA Blue qPCR MasterMix (Eurogentec), 0.01 _^M fremover primer 5SNTS-23F, 0.6 (dvl revers primer 5SNTS-23R+3 ferdigstilt med destillert vann. Den to-trinns PCR betingelsene besto av 5 min aktivering ved 95 °C etterfulgt av 30 sykluser av 95 °C i 20 sek og 72 °C i 30 sek. Produktene ble visualisert på 1.2 % agarose gel (Fermentas) farget med SybrGreen (Se Figur 8).

_fxl sluttreaksjonsblandinger ved hjelp av en CFX - 96 qPCR maskin (Bio - Rad, Hercules , CA,

CA, USA), 0.2 \ M fremover primer sdYF , 0.2 n-M revers primer sdYR2 , 0.05 \ M fremover primer 18SF og 0,05 revers primer 18SR ferdigstilt med destillert vann. Den to-trinns tosidige PCR betingelsene besto av 2 min aktivering ved 98 °C etterfulgt av 40

sykluser med 98 °C i 5 sek og 65 °C i 15 sek. Smeltekurveanalysen utført etter amplifisering ble gjennomført ved å øke temperaturen trinnvis med 0.2 °C fra 65 °C

S. salar fiskeprøver ble samlet inn og behandlet med DNA-ekstraksjon og måling som beskrevet i Eksempel 1. DNA-prøver (2.5 _^l) ble amplifisert som beskrevet i Eksempel 2, ved å benytte primere som er beskrevet i Eksempel 1 og 2, i alt 3 primerpar. Triplex PCR amplifiserte produkter ble videre analysert ved smelteanalyse som beskrevet i Eksempel 2, ved hjelp av "High Resolution Melt analysis", eller alternativt ved gel elektroforese.

1. Mullis, K., et al., Specific Enzymatic Amplification of DNA Invitro - the Polymerase Chain- Reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 1986. 51: p. 263-273. 2. Newton, C.R., et al., Analysis of any point mutation ₅ in DNA. The amplification refractory mutation system ( ARMS). Nucleic Acids Res, 1989. 17(7): p. 2503-16. 3. Bottema, CD. and S.S. Sommer, PCR amplification of specific alleles: rapid detection ofknown mutations andpolymorphisms. MutatRes, 1993. 288(1): p. 93-102. 4. Sommer, S.S., et al., A novel methodfor detecting point mutations or polymorphisms and its application to population screening for carriers ofphenylketonuria. Mayo Clin Proe, 1989. 64(11): p. 1361-72. 5. Liu, Q., et al., Overlapping PCR for Bidirectional PCR Amplification of Specific Alleles: A Rapid One- Tube Method for Simultaneously Differentiating Homozygotes and Heterozygotes. Genome Research, 1997. 7(4): p. 389-398. 6. Cha, R.S., et al., Mismatch amplification mutation assay ( MAMA) : application to the c-H- rasgene. PCR Methods Appl, 1992. 2(1): p. 14-20. 7. Glaab, W.E. and T.R Skopek, A novel assay for allelic discrimination that combines the fluorogenic 5' nuclease polymerase chain reaction ( TaqMan) and mismatch amplification mutation assay. MutatRes, 1999. 430(1): p. 1-12. 8. Birdsell, D.N., et al., Melt analysis of mismatch amplification mutation assays ( Melt-MAMA) : a functional study of a cost- effective SNP genotyping assay in bacterial models. PLoS One, 2012. 7(3): p. e32866. 9. Urke, H., et al., Seawater tolerance in Atlantic salmon, Salmo salar L., brown trout, Salmo trutta L., and S. salar x S. trutta hybrids smolt. Fish Physiology and Biochemistry, 2010. 36(4): p. 845-853. 10. Carrera, E., et al., Identification of smoked Atlantic salmon ( Salmo salar) and rainbow trout ( Onchorhynchus mykiss) using PCR- restriction fragment length polymorphism of the p53 gene. Journal of Aoac International, 2000. 83(2): p. 341-346. 11. Kusser, W.C., R.L. Parker, andX.L. Miao, Polymerase Chain- Reaction andDNAw Sequence ofRainbow- Trout Tumor- Suppressor Gene- P53 Exon- 5, Exon- 6 andExon- 7

12. Dalvin, S., et al., Forensic Identification of severely degraded Atlantic salmon ( Salmo

1(1): p. 12.

13. Rasmussen, R.S., M.T. Morrissey, and J. Walsh, Application of a PCR- RFLP Method to Identify Salmon Spedes in US Commercial Products. Journal of Aquatic Food Product Technology, 2010. 19(1): p. 3-15. 14. Pendas, A.M., et al., Chromosomal mapping and nucleotide sequence of two tandem repeats of Atlantic salmon 5S rDNA. Cytogenetic and Genome Research, 1994. 67(1): p. 31-36. 15. Komiya, H., et al., Determination of nucleotide sequence of 5S ribosomal RNA from rainbow trout liver by high performance liquid ₅ chromatography. Nucl. Acids Res., 1978. l(suppl_2): p. s467-472. 16. Pendas, A.M., et al., Applications of 5S- rDNA in Atlantic salmon, brown trout, and in Atlantic salmon X brown trouthybrid identification.. Molecular Ecology, 1995. 4(2): p. 275-276. 17. Brunelli, J.P. and GH. Thorgaard, A new Y- chromosome- specific marker for Pacific salmon. Transactions of the American Fisheries Society, 2004. 133(5): p. 1247-1253. 18. Brunelli, J.P., et al., Y- specific sequences and polymorphisms in rainbow trout and Chinook salmon. Genome, 2008. 51(9): p. 739-748. 19. Devlin, RH., Sequence of sockeye- salmon type- 1 and type- 2 growth hormone genes and the relationship of rainbow- trout w ith Atlantic and Pacific salmon. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic

Sciences, 1993. 50(8): p. 1738-1748. 20. Devlin, RH., et al., Variation ofY- chromosome DNA markers in Chinook salmon ( Oncorhynchus tshawytscha) populations. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 2005. 62(6): p. 1386-1399. 21. Du, S.J., R.H. Devlin, and CL. Hew, Genomic structure of growth hormone genes in chinook salmon ( Oncorhynchus tshawytscha) : presence of two functional genes, GH- I and GH-II, and a male- specific pseudogene, GH- W. DNA and Cell Biology, 1993. 12(8): p. 739-751. 22. Li, J., et al., Identification of the Sex Chromosomes of Brown Trout ( Salmo trutta) and Their Comparison with the Corresponding Chromosomes in Atlantic Salmon ( Salmo

2011. 133(1): p. 25-33. 23. Veldhoen, N, et al., Gene expressionprofiling and environmental contaminant assessment of migrating Pacific salmon in the Fraser River watershed of British Columbia. Aquatic Toxicology, 2010. 97(3): p. 212-225. 24. Devlin, RH., CA. Biagi, and D.E. Smailus, Genetic mapping ofY- chromosomalDNA

25. Devlin, R.H., et al., A rapid PCR- based test for Y- chromosomal DNA allows simple production of all- female strains of chinook salmon. Aquaculture, 1994. 128(3-4): p. 211-220. 26. Yano, A., et al., An Immune- Related Gene Evolved into the Master Sex- Determining Gene in Rainbow Trout, Oncorhynchus mykiss. Current Biology, 2012. 22(15): p. 1423-1428. 27. Angles cTAuriac M.B., Urke H. A., and Kristensen T. A rapid qPCR methodfor genetic sex identification of Salmo salar and Salmo trutta including simultaneous elucidation of interspecies hybridpaternity by high- resolution melt analysis. Journal of Fish Biology, 2014. 84(6): 1971-1977. 28. Wangh, L.J., et al., Late PCR, WIPO, Editor. 2003, Brandeis University (415 South Street Waltham, MA, 02454-9110, US); Wangh, Lawrence ₅ J. (20 Duffield Road Auburndale, MA, 02466, US); Pierce, Kenneth (52 Walnut Street Natick, MA, 01760, US); Hartshorn, Cristina (1560 Great Plain Avenue Needham, MA, 02492, US); Rice,

John (268 Common Street Quincy, MA, 02169, US); Sanchez, Aquiles J. (14 Foster Drive Framingham, MA, 01701, US).

29. Sanchez, J. A., et al., Linear- After- The- Exponential ( LATEJ- PCR: An advanced method of asymmetric PCR and its uses in quantitative real- time analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004. 101(7): p. 1933-

1938. 30. Dieffenbach, C.W., T.M.J. Lowe, and G.S. Dveksler, General Concepts for Per Primer Design. Pcr-Methods and Applications, 1993. 3(3): p. S30-S37.

32. Barciszewska, M.Z., et al., Structure and functions of 5S rRNA. Acta Biochimica Polonica, 2001. 48(1): p. 191-198. 33. Richard, G-F., A. Kerrest, andB. Dujon, Comparative Genomics andMolecular Dynamics of DNA Repeats in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology

Reviews, 2008. 72(4): p. 686-727.