Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelser som foreviser serotoninreopptaksinhiberingsaktivitet kombinert med en aktivitet på serotoninreseptoren 1A (5-HT_1A) og serotoninreseptoren 3 (5-HT₃), og som sådan er nyttige i behandling av CNS-relaterte sykdommer.

Oppfinnelsens bakgrunn

Selektive serotonin-reopptaksinhibitorer (SSRI) har i årevis vært førstevalgsterapeutika i behandlingen av visse CNS-relaterte sykdommer, særlig depresjon, angst og sosiale fobier fordi de er effektive, godt tolererte og har en fordelaktig sikkerhetsprofil sammenlignet med tidligere anvendte forbindelser, dvs. de klassiske tricykliske forbindelsene.

Ikke desto mindre er terapeutisk behandling med anvendelse av SSRI hemmet av en vesentlig fraksjon av ikke-respondere, dvs. pasienter som ikke responderer eller bare responderer i begrenset omfang på SSRI-behandling. Det er videre typisk at en SSRI-behandling ikke begynner å vise en effekt før etter flere ukers behandling.

For å omgå noen av disse manglene ved SSRI-behandling anvender psykiatere noen ganger forsterkningsstrategier. Forsterkning av antidepressiva kan oppnås f. eks. ved kombinasjon med stemningsstabiliserende forbindelser, slik som litiumkarbonat eller trijodthyronin, eller ved parallell anvendelse av elektrosjokk.

Det er kjent at en kombinasjon av inhibering av serotonintransportøren (SERT) med en aktivitet på en eller flere serotoninreseptorer kan være fordelaktig. Man har tidligere funnet at kombinasjonen av en serotonin-reopptaksinhibitor med en forbindelse som har 5-HT_2C-antagonistisk eller -invers agonistisk effekt (forbindelser som har en negativ virkning ved 5-HT_2C-reseptoren) gir en betydelig økning av 5-HT (serotonin)-nivået i terminale områder, som målt i mikrodialyseeksperimenter (WO 01/41701). Dette vil innebære raskere inntreden av antidepressiv effekt i klinikken og en forsterkning eller potensering av den terapeutiske effekten av serotoninreopptaksinhibitoren (SRI).

Likeledes er det blitt rapportert at kombinasjonen av pindolol, som er en partiell 5-HT_1A agonist, med en serotonin-reopptaksinhibitor gir opphav til hurtig effektinntreden .[Psych. Res, 125, 81-86, 2004].

CNS-relaterte sykdommer, slik som f. eks. depresjon, angst og schizofreni er ofte komorbide med andre lidelser eller dysfunksjoner slik som kognitive mangler eller svekkelse [Scand.J.Psych, 43, 239-251, 2002; Am.J.Psych, 158, 1722-1725, 2001].

Flere nevrotransmittere antas å være involvert i de nevronale hendelsene som regulerer kognisjon. I særdeleshet spiller det kolinerge systemet en fremtredende rolle i kognisjon, og forbindelser som påvirker det kolinerge systemet er således potensielt nyttige i behandlingen av kognitiv svekkelse. Forbindelser som påvirker 5-HT_1A-reseptoren og/eller 5-HT₃-reseptoren er kjent for å påvirke det kolinerge systemet, og de kan som sådan være nyttige i behandlingen av kognitiv svekkelse.

En forbindelse som foreviser 5-HT_1A- og/or 5-HT₃-reseptoraktivitet ville derfor forventes å være nyttig i behandlingen av kognitiv svekkelse. En forbindelse som dessuten også foreviser SERT-aktivitet ville være spesielt nyttig i behandlingen av kognitiv svekkelse hos deprimerte pasienter da en slik forbindelse også ville gi hurtig inntreden av behandlingen av depresjonen.

WO 03/029232 beskriver f. eks. forbindelsen 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)fenyl]piperazin (eksempel 1e) som en forbindelse som har SERT-aktivitet.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har overraskende funnet at 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)fenyl]piperazin utøver en kombinasjon av SERT-inhibering, 5-HT₃-antagonisme og partiell 5-HT_1A agonisme. I en utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse følgelig forbindelse I som er 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)fenyl]piperazin og farmasøytisk akseptable salter derav, hvilken forbindelse er krystallinsk.

I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen anvendelsen av forbindelse I i terapi.

I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning som omfatter forbindelse I.

I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen anvendelsen av forbindelse I i fremstillingen av et medikament.

Figurer

Figur 1: XRPD av krystallinsk base

Figur 2: XRPD av alfaform av hydrobromidsalt

Figur 3: XRPD av betaform av hydrobromidsalt

Figur 4: XRPD av gammaform av hydrobromidsalt

Figur 5: XRPD av hemihydrat av hydrobromidsalt

Figur 6: XRPD av blandingen av etylacetatsolvatet og alfaformen av hydrobromidsaltet

Figur 7: XRPD av hydrokloridsalt

Figur 8: XRPD av monohydrat av hydrokloridsalt

Figur 9: XRPD av mesylatsalt

Figur 10: XRPD av fumaratsalt

Figur 11: XRPD av maleatsalt

Figur 12: XRPD av meso-tartratsalt

Figur 13: XRPD av L-(+)-tartratsalt

Figur 14: XRPD av D-(+)-tartratsalt

Figur 15: XRPD av sulfatsalt

Figur 16: XRPD av fosfatsalt

Figur 17: XRPD av nitratsalt

Figur 18: Effekt av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse i den intradermale formalintesten. X-aksen viser administrert mengde av forbindelse; Y-aksen viser tidsrommet (sekunder) medgått til å slikke poten. Figur 18a: Respons i perioden 0-5 minutter; Figur 18b: Respons i perioden 20-30 minutter

Figur 19a: Ekstracellulære acetylkolinnivåer i prefrontal korteks hos frittgående rotter ved administrasjon av 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)fenyl]piperazin-HBr-salt.

Figur 19b: Ekstracellulære acetylkolinnivåer i ventral hippocampus hos frittgående rotter ved administrasjon av 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)fenyl]piperazin-HBr-salt. Figur 20: Effekt av 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)fenyl]piperazin-HBr-salt på kontekstuell betinging av frykt hos Sprague-Dawley-rotter når det ble gitt 60 minutter før ervervelse. Fryktlammet atferd ble bedømt i en 58 sek. tilvenningsperiode før fotsjokket US (ervervelse før sjokk) (hvite søyler). Fryktlammet atferd ble målt 24 timer etter trening (retensjonstest) (svarte søyler).

Figur 21: Effekt av 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)fenyl]piperazin-HBr-salt på kontekstuell betinging av frykt hos Sprague-Dawley-rotter når det ble gitt 1 time før retensjonstesten. Fryktlammet atferd ble bedømt i en 58 sek periode før fotsjokket US (ervervelse) (hvite søyler). Fryktlammet atferd ble målt 24 timer etter trening (retensjonstest) (svarte søyler).

Figur 22: Effekt av AA21004 (1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)fenyl]piperazin-HBr-salt) på kontekstuell betinging av frykt hos Sprague-Dawley-rotter når det ble gitt umiddelbart etter ervervelse. Fryktlammet atferd ble bedømt i en 58 sek. tilvenningsperiode før fotsjokket US (ervervelse før sjokk) (hvite søyler). Fryktlammet atferd ble målt 24 timer etter trening (retensjonstest) (svarte søyler).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen:

Oppfinnelsen vedrører forbindelse I, 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin, hvis struktur er

og farmasøytisk akseptable salter derav, hvilken forbindelse er krystallinsk.

I en utførelsesform er de farmasøytisk akseptable saltene syreaddisjonssalter av ikke-toksiske syrer. Saltene inkluderer salter fremstilt fra organiske syrer, slik som malein-, fumar-, benzo-, askorbin-, rav-, oksal-, bis-metylensalisyl-, metansulfon-, etandisulfon-, eddik-, propion-, vin-, salisyl-, sitron-, glukon-, melke-, eple-, mandel-, kanel-, metylmalein-, asparagin-, stearin-, palmitin-, itakon-, glykol-, p-amino-benzo-, glutamin-, benzensulfon-, teofyllin-eddiksyre, samt 8-haloteofylliner, f.eks.8-bromteofyllin. Saltene kan også fremstilles fra uorganiske salter, slik som salt-, hydrobrom-, svovel-, sulfamin-, fosfor- og salpetersyre. Spesielt kan nevnes salter fremstilt fra metansulfonsyre, maleinsyre, fumarsyre, meso-vinsyre, (+)-vinsyre, (-)vinsyre, saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre og salpetersyre. Distinkt kan hydrobromidsaltet nevnes.

Orale doseringsformer, og spesielt tabletter, foretrekkes ofte av pasientene og legen på grunn av den enkle administrasjonen og følgelig bedre overensstemmelse. Det foretrekkes at de aktive ingrediensene er krystallinske i tabletter. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er krystallinske.

I en utførelsesform er krystallerne ifølge foreliggende oppfinnelse solvater, dvs. krystaller hvori solvente molekyler fra del av krystallstrukturen. Solvatet kan dannes fra vann, i hvilket tilfelle solvatene ofte benevnes hydrater. Alternativt kan solvatene dannes av andre løsningsmidler, slik som f. eks. etanol, aceton eller etylacetat. Den nøyaktige mengden av solvatet avhenger ofte av forholdene. For eksempel vil hydrater typisk avgi vann hvis temperaturen økes eller den relative fuktigheten senkes.

I en utførelsesform er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse usolvatiserte krystaller.

Noen forbindelser er hygroskopiske, dvs. de absorberer vann når de eksponeres for fuktighet. Hygroskopisitet betraktes generelt som en uønsket egenskap for forbindelser som skal presenteres i en farmasøytisk formulering, særlig i en tørr formulering slik som tabletter. I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen krystaller med lav hygroskopisitet. For orale doseringsformer som anvender krystallinske aktive ingredienser, er det også fordelaktig hvis krystallene er veldefinerte. I foreliggende sammenheng betyr uttrykket ”veldefinert” særlig at støkiometrien er veldefinert, dvs. at forholdet mellom ionene som danner saltet er forholdet mellom små heltall slik som 1:1, 1:2, 2:1, 1:1:1, osv. I en utførelsesform er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse veldefinerte krystaller.

De krystallinske forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan eksistere i mer enn én form, dvs. de kan eksistere i polymorfe former. Polymorfe former kan eksistere hvis en forbindelse kan krystallisere i mer enn én form. Foreliggende oppfinnelse er ment å omfatte alle slike polymorfe former, enten som rene forbindelser eller som blandinger derav.

I en utførelsesform er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse i en renset form. Uttrykket ”renset form” er ment å indikere at forbindelsen hovedsakelig er fri for andre forbindelser eller andre former av den samme forbindelsen, alt etter som.

I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen krystallinske salter av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse med XRDP som vist i figur 1 – 17, og især figur 2, 3, 4 og 5.

Tabellen under viser de viktigste XRDP-refleksjonene for forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse.

l r n n i n r °2 ll r i r ± 1°

Som vist f. eks. i figur 2 – 5, kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, in casu hydrobromidsaltet, eksistere i flere former, dvs. være polymorfe. De polymorfe formene har forskjellige egenskaper, og som vist i eksempel 4d.

Betaformen av hydrobromidsaltet er den mest stabile som vist ved det høyere DSC-smeltepunktet og den lavere løseligheten. Videre har betaformen en attraktiv kombinasjon av lav hygroskopisitet og løselighet, hvilket gjør denne forbindelsen spesielt egnet til å fremstille tabletter. Derfor tilveiebringer oppfinnelsen i en utførelsesform hydrobromidsaltet av 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin med XRDP-refleksjoner ved cirka 6,89, 9,73, 13,78 og 14,62 (°2q), og særlig med en XRDP som vist i figur 3.

Løseligheten av en aktiv ingrediens er også av betydning for valget av doseringsform da det kan ha en direkte innvirkning på biotilgjengeligheten. For orale doseringsformer er det generelt antatt at en høyere løselighet av den aktive ingrediensen er fordelaktig fordi den øker biotilgjengeligheten.

Kolinerg nevrotransmisjon i korteks og hippocampus er av stor betydning for kognisjon, og en rekke prekliniske observasjoner peker på viktigheten av serotoninreseptoren 1A (5-HT_1A) for dette systemet. T. Koyama beskriver i Nevrosci.Lett, 265, 33-36, 1999 at 5-HT_1A-agonistene BAYX3702 øker utstrømningen av acetylkolin fra korteks og hippocampus hos rotter. Interessant nok er 5-HT_1A-antagonisten WAY-100635 i stand til å eliminere effekten av BAYX3702, hvilket viser at effekten av BAYX3702 er 5-HT_1A-mediert.

En rekke studier har rapportert en effekt av 5-HT_1A-modulatorer på kognitiv svekkelse. A. Meneses i Nevrobiol. Learn.Memory, 71, 207-218, 1999 beskriver at den partielle 5-HT_1A-agonisten (±)-8-hydroksy-2-(di-n-propylamino)-tetralin, HCl (8-OH-DPAT) letter konsolideringen av læring hos normale rotter og normaliserer kognitive funksjoner hos kognitivt svekkede rotter.

Disse prekliniske observasjoner synes å bli reflektert i klinikken også. T Sumiyoshi i Am.J.Psych, 158, 1722-1725, 2001 beskriver en studie hvor pasientene fikk typiske antipsykotika, slik som haloperidol, sulprid og pimozid, som alle mangler 5-HT_1A-aktivitet, i kombinasjon med placebo eller tandospiron, som er en 5-HT_1A-agonist. Pasienter som fikk tandospiron på toppen av antipsykotikumet viste en forbedring i sin kognitive prestasjon mens pasienter som fikk placebo ikke gjorde det. Likeledes forbedrer atypiske antipsykotika, slik som clozapin, som også er 5-HT_1A-agonister, kognisjon hos schizofrene pasienter mens typiske antipsykotika, slik som haloperidol, som ikke har noen 5-HT_1A-aktivitet, ikke gjør det, Y. Chung, Brain Res, 1023, 54-63, 2004.

Som nevnt ovenfor, antas det kolinerge system å være involvert i de nevronale hendelsene som regulerer kognisjon, og det kolinerge system kan være underkastet en inhibitorisk kontroll av serotoninreseptoren 3 (5-HT₃) [(Giovannini et al, J Pharmacol Exp Ther 1998, 285:1219-1225; Costall og Naylor, Current Drug Targets – CNS & Neurobiol Disord 2004, 3: 27-37)].

I en tilvenningstest hos mus, i en forsterket alterneringsoppgave i en T-labyrint for rotter og i en objektdiskriminerings- og reverseringslæringsoppgave hos ekornapen, reduserte ondansetron svekkelsen forårsaket av muskarinantagonisten skopolamin eller lesjonene i de kolinerge baner med utspring i nucleus basalis (Barnes et al, Pharamcol Biochem Behav 1990, 35: 955-962; Carey et al, Pharamcol Biochem Behav 1992, 42: 75-83). Boast et al (Neurobiol Learn Mem 1999, 71: 259-271) anvendte MK-801, en ikke-kompetitiv antagonist for NMDA-reseptoren for å avbryte den kognitive prestasjonsevnen hos rotter opplært i en forsinket ikke-matchende til prøve (DNMS) radial labyrintoppgave. Det ble vist at ondansetron blokkerte den kognitive svekkelsen. Videre, i en studie av amnesieffekten av etanol i en passiv unngåelsesoppgave hos mus, ble denne amnesieffekten av etanol delvis gjenopprettet til det normale av ondansetron (Napiorkowska-Pawlak et al, Fundam Clin pharmacol 2000, 14: 125-131). Således indikerer lettelse av den kolinerge transmisjon av 5-HT₃-antagonisme etter svekkelse av det kolinerge systemet i prekliniske modeller (Diez-Ariza et al, Psychopharmacology 2003, 169: 35-41; Gil-Bea et al, Nevropharmcol 2004, 47: 225-232), foreslår en basis for anvendelse av denne behandlingen i terapien av kognitive lidelser.

I en randomisert, dobbeltblind overkrysningsstudie i friske menn viste vurdering av verbalt og romlig minne og vedvarende oppmerksomhet at 5-HT₃-antagonisten, alosetron forsterket skopolamininduserte mangler i verbalt og romlig minne (Preston, Recent Advances in the treatment of Neurodegenerative disorders and cognitive function, 1994, (red.) Racagni og Langer, Basel Karger, s.89-93).

Avslutningsvis antas det at forbindelser som utøver partiell 5-HT_1A-agonistisk aktivitet i kombinasjon med 5-HT₃-antagonistisk aktivitet er spesielt nyttige i behandlingen av kognitiv svekkelse. Forbindelser som videre utøver serotoninreopptaksinhibering vil være spesielt nyttige i behandling av kognitiv svekkelse assosiert med depresjon da serotonin-reopptaksinhibering i kombinasjon med partiell 5-HT_1A-agonisme vil føre til en hurtigere inntreden av effekten av depresjonsbehandlingen.

Som vist i eksempel 1, er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse potente inhibitorer av den humane serotonintransportør, dvs. de inhiberer reopptak av serotonin. Videre er forbindelsene potente antagonister av 5-HT₃-reseptoren hos mus, rotter, marssvin og hund. den humane 5-HT₃-reseptoren, klonet inn i oocytter, fant man at forbindelsene var antagonister ved lave konsentrasjoner (IC₅₀ ca.30 nM), mens forbindelsene viste agonistiske egenskaper ved høyere konsentrasjoner (ED₅₀ = 2,1 µM). En etterfølgende anvendelse av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse ved høy konsentrasjon viste ingen agonistisk respons, hvilket kan skyldes hurtig desensibilisering eller direkte antagonisme in vitro. Således viser forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse en markert antagonisme ved den humane 5-HT₃-reseptor som observert på 5-HT₃-reseptoren hos andre arter.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse binder med svært lav affinitet til 5-HT_1A-reseptoren i hjernehomogenat fra både rotter og mus. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse binder imidlertid til den humane 5-HT_1A-reseptoren med en K_i på 40 nM. Videre viser funksjonelle data at forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er partielle agonister ved den humane 5-HT_1A-reseptoren idet de utviser en virkning på 85 %.

Det forventes at aktiviteten av foreliggende oppfinnelse ved SERT-, 5-HT₃- og 5-HT_1A-reseptorer bidrar til forbindelsens in vivo-profil hos mennesker.

Som vist i eksempel 26 gir forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse opphav til en stigning i det ekstacellulære acetylkolinnivået i den prefrontale korteksen og den ventrale hippocampus hos rotter. Disse prekliniske funnene forventes å bli omsatt til en klinisk effekt i behandlingen av kognitive svekkelser, jfr. anvendelsen av acetylkolin-esteraseinhibitorer i behandlingen av kognitive svekkelser, f. eks. i Alzheimers sykdom. Videre støtte for dette synspunktet kan finnes i eksempel 27, hvori data viser at forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse forbedrer kontekstuelt minne hos rotter. Alt i alt antyder den farmakologiske profilen til forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kombinert med effektene på acetylkolinnivåer og minne hos rotter stertkt at forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige i behandlingen av kognitiv svekkelse.

Kognitive mangler eller kognitiv svekkelse inkluderer en tilbakegang i kognitive funksjoner eller kognitive domener, f. eks arbeidsminne, oppmerksomhet og årvåkenhet, verbal læring og minne, visuell læring og minne, resonnering og problemløsing, f. eks utførende funksjon, prosesseringshastighet og/eller sosial kognisjon. Spesielt kan kognitive mangler eller kognitiv svekkelse indikere mangler i oppmerksomhet, desorganisert tenking, sakte tenking, vanskeligheter med å forstå, dårlig konsentrasjon, svekkelse i problemløsning, dårlig minne, vanskeligheter med å uttrykke tanker og/eller vanskeligheter i integrasjonen av tanker, følelser og atferd, eller vanskeligheter med ekstinksjon av irrelevante tanker. Uttrykkene ”kognitive mangler” og ”kognitiv svekkelse” er ment å indikere det samme og anvendes omveklsende.

I en utførelsesform er pasienten også diagnostisert med en annen CNS-lidelse, slik som affektive lidelser slik som depresjon, generalisert depresjon, alvorlig depressiv lidelse, angstlidelser inklusive generell angstlidelse og panikklidelse, obsessiv-kompulsiv lidelse, schizofreni, Parkinsons, demens, AIDS-demens, ADHD, aldersassosiert minnesvekkelse eller Alzheimers.

Kognitiv svekkelse er blant de klassiske trekk ved depresjon, slik som f. eks. alvorlig depressiv lidelse. Kognitive lidelser kan i en viss grad være sekundært til depresjon på den måten at en forbedring av den depressive tilstanden også vil føre til en forbedring av den kognitive svekkelsen. Det er imidlertid også klare bevis på at kognitive lidelser faktisk er uavhengige av depresjon. For eksempel har studier vist vedvarende kognitiv svekkelse etter helbredelse fra depresjon [J.Nervous Mental Disease, 185, 748-754, 197]. Den differensielle effekten av antidepressiva på depresjon og kognitive svekkelser gir videre ytterligere støtte for oppfattelsen av at depresjon og kognitiv svekkelse er uavhengige, men ofte komorbide tilstander. Selv om medikamenter med serotonin og noradrenalin gir sammenlignbare forbedringer i depressive symptomer, har flere studier vist at moduleringen av det noradrenerge systemet ikke forbedrer de kognitive funksjonene så mye som serotoninmodulering. Bull, 58, 345-350, 2002; Hum Psychpharmacol, 8, 41-47, 1993].

Det antas at behandlingen av kognitiv svekkelse hos deprimerte pasienter ved å administrere forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt fordelaktig. Den multifasetterte farmakologien til forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, særlig SERT-, 5-HT₃- og 5-HT_1A-aktiviteten forventes å føre til forbedring i kognitiv funksjon i kombinasjon med en hurtig innsettende behandling av den deprimerte tilstanden.

Kognitiv svekkelse er en særlig viktig overveielse hos de eldre. Kognitiv svekkelse øker normalt med alderen, og videre med depresjon. I en utførelsesform er derfor pasienten som skal behandles for kognitiv svekkelse eldre, og særlig eldre med depresjon.

Kognitive funksjoner er, som nevnt ovenfor, ofte svekket hos schizofrene pasienter. Studier har også konkludert med at kognitiv funksjonsevne er forbundet med yrkesmessig funksjon i schizofreni [Scizophrenia Res, 45, 175-184, 2000]. I en utførelsesform er pasienten som skal behandles for kognitiv svekkelse schizofren.

5-HT₃-reseptorantagonister har i tillegg blitt foreslått i behandlingen av sykdommer slik som kvalme, kjemoterapiindusert kvalme, trang, substansmisbruk, smerte, irritabelt tarmsyndrom (IBS), schizofreni og spiseforstyrrelser, [Eur. J.

Pharmacol, 560, 1-8, 2007; Pharmacol. Therapeut, 111, 855-876, 2006; Alimentary Pharmacol.Ther, 24, 183-205, 2006]

Kliniske studier viser at en kombinasjon av mirtazipin og en SSRI er bedre enn SSRI-er alene i behandlingen av deprimerte pasienter med en utilstrekkelig klinisk respons (behandlingsresistent depresjon, TRD, eller refraktær depresjon) [Psychother. Psychosom, 75, 139-153, 2006]. Mirtazipin er en 5-HT₂- og en 5-HT₃-antagonist hvilket støtter oppfattelsen av at forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige i behandlingen av TRD.

Hetetokter er et symptom assosiert med den menopausale overgangen. Noen kvinner kan lide av dette i et slikt omfang at det interfererer med søvn eller aktiviteter generelt, og hvor behandling er nødvendig. Hormonerstatningsterapi med østrogen har vært etablert praksis i årtier, men nylig har det imidlertid blitt uttrykt bekymringer om bivirkningene, slik som brystkreft og hjerteproblemer. Kliniske studier med SSRI-er har vist at disse forbindelsene har en effekt på hetetokter, men mindre enn østrogen [J.Am.Med.Ass, 295, 2057-2071, 2006]. Behandling av hetetokter med forbindelser som inhiberer reopptak av serotonin, f. eks. forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kunne imidlertid være en alternativ behandling for kvinner som ikke kan eller vil akseptere østrogen.

Søvnapné eller obstruktivt søvnapné-hypopnésyndrom eller obstruktiv ”sleepdisordered breathing” er en lidelse hvor det gjenstår å identifisere en effektiv farmakoterapi. Flere dyrestudier antyder imidlertid at 5-HT₃-antagonister, f. eks forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan være effektive i behandlingen av disse sykdommene [Sleep, 21, 131-136, 1998; Sleep, 8, 871, 878, 2001].

Det er velkjent at behandling med antidepressiva generelt og spesielt SSRI-er kan være assosiert med seksuell dysfunksjon, noe som ofte fører til avbrudd i behandlingen. Så mye som 30-70 % av pasienter på SSRI-er melder om mangler i seksuell funksjon [J.Clin.Psych, 66, 844-848, 2005], og manglene inkluderer nedsatt libido, forsinket, redusert eller uteblitt orgasme, minsket opphisselse og erektil dysfunksjon. I alt 114 individer har blitt utsatt for forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse i kliniske forsøk; av disse 114 individer rapporterte bare 1 individ om seksuell dysfunksjon. Disse data antyder at klinisk intervensjon hvor det anvendes forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er assosiert med forbausende få mangler i seksuell funksjon.

Som nevnt ovenfor, er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse spesielt velegnet til behandlingen av kronisk smerte. Kronisk smerte inkluderer indikasjoner slik som fantomsmerter, nevropatisk smerte, diabetisk nevropati, post-herpetisk nevralgi (PHN), karpaltunnellsyndrom (CTS), HIV-nevropati, komplekst regionalt smertesyndrom (CPRS), trigeminal nevralgi/trigeminusnevralgi/tic douloureux, kirurgisk intervensjon (f. eks. postoperativ analgesi), diabetisk vaskulopati, kapillær motstand eller diabetiske symptomer assosiert med insulitt, smerte assosiert med angina, smerte assosiert med menstruasjon, smerte assosiert med kreft, tannpine, hodepine, migrene, spenningshodepine, trigeminal nevralgi, temporomandibulært leddsyndrom, myofascial smerte, muskelskade, fibromyalgisyndrom, ben- og leddsmerte (osteoartritt), revmatoid artritt, revmatoid artritt og ødem som følge av traume assosiert med brannskader, benbrist- eller benbruddssmerte på grunn av osteoartritt, osteoporose, benmetastaser eller ukjente årsaker, gikt, fibrositt, myofascial smerte, toraksapertursyndromer (TOS), smerter i den øverste delen av ryggen eller i den nederste delen av ryggen (hvori ryggsmerten skyldes systemisk, regional eller primær ryggradssykdom (radikulopati)), bekkensmerte, kardial brystsmerte , ikke-kardial brystsmerte, ryggmargsskade (SCI)-assosiert smerte, sentral smerte etter slag, kreftnevropatier, AIDS-smerte, sigdcellesmerte eller geriatrisk smerte.

Data presentert i eksempel 16 viser at forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige i behandlingen av smerte, og at de også kan ha en analgetisk effekt. Tilleggsstudier i en dyremodell for nevropatisk smerte bekrefter denne observasjonen.

Uttrykket ”behandling” og ”å behandle” som anvendt heri betyr behandling og pleie av en pasient med det formål å bekjempe en tilstand, slik som en sykdom eller lidelse. Uttrykket er ment å inkludere det fulle spektrum av behandlinger for en gitt tilstand som pasienten lider av, slik som administrasjon av den aktive forbindelsen for å lindre symptomene eller komplikasjonene, for å forsinke progresjonen av sykdommen, lidelsen eller tilstanden, for å lindre eller lette symptomene og komplikasjonene og/eller for å kurere eller eliminere sykdommen, lidelsen eller tilstanden samt å forbygge tilstanden, hvori forebyggelse skal forstås som behandling og pleie av en pasient med det formål å bekjempe sykdommen, tilstanden eller lidelsen og inkluderer administrasjonen av de aktive forbindelsene for å forebygge inntreden av symptomer eller komplikasjoner. Ikke desto mindre er profylaktisk (preventiv) og terapeutisk (kurativ) behandling to separate aspekter av oppfinnelsen. Pasienten som skal behandles er fortrinnsvis et pattedyr, særlig et menneske.

Behandling ved anvendelse av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse vil typisk involvere daglig administrasjon av forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Dette kan involvere administrasjon en gang om dagen eller administrasjon to ganger om dagen eller enda oftere.

I en utførelsesform vedrører oppfinnelsen en anvendelse av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstillingen av et medikament til behandling av affektive lidelser, depresjon, alvorlig depressiv lidelse, postnatal depresjon, depresjon assosiert med bipolar lidelse, Alzheimers sykdom, psykose, kreft, alder eller Parkinsons sykdom, angst, generell angstlidelse, sosial angstlidelse, obsessivkompulsiv lidelse, panikklidelse, panikkanfall, fobi, sosial fobi, agorafobi, stress urininkontinens, emese, IBS, spiseforstyrrelser, kronisk smerte, delvise respondere, behandlingsresistent depresjon, Alzheimers sykdom, kognitiv svekkelse, ADHD, melankoli, PTSD, hetetokter, søvnapné, alkohol-, nikotin- eller karbohydrattrang, stoffmisbruk eller alkohol- eller legemiddelmisbruk.

I en utførelsesform vedrører oppfinnelsen forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelser for anvendelse i behandlingen av en sykdom valgt blant affektive lidelser, depresjon, alvorlig depressiv lidelse, postnatal depresjon, depresjon assosiert med bipolar lidelse, Alzheimers sykdom, psykose, kreft, alder eller Parkinsons sykdom, angst, generell angstlidelse, sosial angstlidelse, obsessiv-kompulsiv lidelse, panikklidelse, panikkanfall, fobi, sosial fobi, agorafobi, stress urininkontinens, emese, IBS, spiseforstyrrelser, kronisk smerte, delvise respondere, behandlingsresistent depresjon, Alzheimers sykdom, kognitiv svekkelse, ADHD, melankoli, PTSD, hetetokter, søvnapné, alkohol-, nikotin- eller karbohydrattrang, stoffmisbruk og alkohol- og medikamentmisbruk.

Effekten av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse på kognisjon hos mennesker kan bedømmes på en rekke måter. Effekten kan bedømmes i tester hvori friske frivillige administreres forbindelsene etterfulgt av en måling av kognitiv prestasjonsevne i anerkjente tester slik som f. eks. Auditory Verbal Learning Test (AVLT), Wisconsin Card Sorting Test (WCST), eller vedvarende oppmerksomhet, [Psycopharmacol, 163, 106-110, 2002; Psychiatry Clin. Neurosci, 60, 70-76, 2006]. Effekten kan selvfølgelig også vurderes hos pasienter som lider av kognitiv svekkelse ved å anvende de samme slags tester. Alternativt kan kognitive modeller anvendes hvori kognitiv svekkelse induseres i friske frivillige og hvori en styrkende effekt av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse måles. Kognitiv svekkelse kan induseres med f. eks. skopolamin, søvndeprivasjon, alkohol og uttømming av tryptofan.

De farmasøytiske formuleringene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved konvensjonelle fremgangsmåter i faget. Spesielt kan tabletter nevnes som kan fremstilles ved å blande den aktive ingrediensen med ordinære adjuvantia og/eller fortynningsmidler og etterfølgende komprimering av blandingen i en konvensjonell tablettmaskin. Eksempler på adjuvantia eller fortynningsmidler omfatter: vannfri kalsiumhydrogenfosfat, PVP, PVP-VA-kopolymerer, mikrokrystallinsk cellulose, natriumstivelseglykolat, maisstivelse, mannitol, potetstivelse, talk, magnesiumstearat, gelatin, laktose, gummier og lignende. Hvilke som helst andre adjuvantia eller additiver som vanligvis anvendes til slike formål slik som fargestoffer, smaksstoffer, konserveringsmidler osv. kan anvendes forutsatt at de er kompatible med de aktive ingrediensene.

Løsninger til injeksjoner kan fremstilles ved å oppløse den aktive ingrediensen og mulige additiver i en del av løsningsmidlet til injeksjon, fortrinnsvis sterilt vann idet man justerer løsningen til ønsket volum, steriliserer løsningen og fyller den i passende ampuller eller hetteglass. Ethvert passende additiv som konvensjonelt anvendes i faget kan settes til, slik som tonisitetsmidler, konserveringsmidler, antioksidanter osv.

De farmasøytiske sammensetningene ifølge denne oppfinnelsen, eller de som fremstilles i samsvar med denne oppfinnelsen, kan administreres via enhver passende rute, for eksempel oralt i form av tabletter, kapsler, pulvere, siruper osv, eller parenteralt i form av løsninger til injeksjon. For fremstilling av slike sammensetninger, kan velkjente fremgangsmåter i faget anvendes , og hvilke som helst farmasøytisk akseptable bærere, fortynningsmidler, eksipienser eller andre additiver som normalt anvendes i faget kan anvendes.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen administreres hensiktsmessig i enhetsdoseringsform som inneholder forbindelsene i en mengde fra ca.1 til 50 mg. Man antar at en øvre grense settes av konsentrasjonsavhengigheten til 5-HT₃-aktiviteten. Den totale daglige dosen er vanligvis i området fra ca.1 – 20 mg, slik som ca. 1 til 10 mg, ca.5 -10 mg, ca.10 – 20 mg eller ca.10 – 15 mg av forbindelsen ifølge oppfinnelsen. Særlig kan det nevnes daglige doser på 5, 10, 15 eller 20 mg.

Tabletter som omfatter en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan hensiktsmessig fremstilles ved våt granulering. Ved å anvende denne fremgangsmåten, blandes de tørre, faste stoffene (aktive ingredienser, fyllstoff, bindemiddel osv.) og fuktes med vann eller et annet fuktemiddel (f. eks. en alkohol) og agglomerater eller granuler bygges opp av de fuktede faste stoffene. Våt knaing fortsettes inntil en ønsket homogen partikkelstørrelse oppnås hvorpå det granulerte produktet tørkes. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse blandes typisk med laktosemonohydrat, maisstivelse og kopovidon i en høyskjærsblander sammen med vann. Etter dannelse av granulater, kan disse granulatene siktes i en sikt med en passende siktstørrelse og tørkes. De resulterende tørkede granulatene blandes deretter med mikrokrystallinsk cellulose, krysskarmellosenatrium og magnesiumstearat hvorpå tablettene komprimeres. Alternativt kan våt granulering av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås ved å anvende mannitol, maisstivelse og kopovidon hvorpå granulatene blandes med mikrokrystallinsk cellulose, natriumstivelseglykolat og magnesiumstearat før tablettene komprimeres. Alternativt kan våt granulering av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås ved å anvende vannfri kalsiumhydrogenfosfat, maisstivelse og kopovidon hvorpå granulatene blandes med mikrokrystallinsk cellulose, natriumstivelseglykolat (type A), talk og magnesiumstearat før tablettene komprimeres. Kopovidon er en PVP-VA-kopolymer.

I en utførelsesform er forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse hydrobromidsyresaltet, for eksempel i betaformen, og passende tabletter kan sammensettes som følger – prosentene som angis er vekt/vekt-%

HBr-salt 2-20 %

Laktosemonohydrat 30-50 %

Stivelse 15-30 %

Kopovidon 3-5 %

Mikrokrystallinsk cellulose 15-25 %

Krysskarmellosenatrium 2-5 %

Magnesiumstearat 0,5-5 %

Spesielt kan tablettene sammensettes som følger

HBr-salt 3-4 %

Laktosemonohydrat 44-46 %

Stivelse 22-23 %

Kopovidon 3-4 %

Mikrokrystallinsk cellulose 20-22 %

Krysskarmellosenatrium 3-3,5 %

Magnesiumstearat 0,5-1 %

eller

HBr-salt 15-16 %

Laktosemonohydrat 35-38 %

Stivelse 18-20 %

Kopovidon 3-4 %

Mikrokrystallinsk cellulose 20-22 %

Krysskarmellosenatrium 3-3,5 %

Magnseiumstearat 0,5-1 %

eller

HBr-salt 1-2 %

Laktosemonohydrat 44-46 %

Stivelse 20-24 %

Kopovidon 3-4 %

Mikrokrystallinsk cellulose 22-24 %

Krysskarmellosenatrium 3-4 %

Magnseiumstearat 0,5-1 %

I en utførelsesform er forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse hydrobromidsyresalt, for eksempel i betaformen, og passende tabletter kan sammensettes som følger:

HBr-salt 2-30 %

Mannitol 25-45 %

Maisstivelse 10-20 %

Kopovidon 2-4 %

Mikrokrystallinsk cellulose 22-27 %

Natriumstivelseglykolat 4-5 %

Magnsesiumstearat 0,25-5 %, slik som 0,25-2 %

Spesielt kan tablettene sammensettes som følger:

HBr-salt 20-22 %

Mannitol 35-36 %

Maisstivelse 10-12 %

Kopovidon 2,5-3 %

Mikrokrystallinsk cellulose 24-25 %

Natriumstivelseglykolat 3-4 %

Magnesiumstearat 0,25-1 %

eller

HBr-salt 12-13 %

Mannitol 36-37 %

Maisstivelse 18-19 %

Kopovidon 3-4 %

Mikrokrystallinsk cellulose 24-25 %

Natriumstivelseglykolat 3-4 %

Magnesiumstearat 0,25-1 %

eller

HBr-salt 25-27 %

Mannitol 27-29 %

Maisstivelse 13-15 %

Kopovidon 3-4 %

Mikrokrystallinsk cellulose 24-25 %

Natriumstivelseglykolat 3-5 %

Magnesiumstearat 0,25-1 %

eller

HBr-salt 3-4 %

Mannitol 40-42 %

Maisstivelse 20-22 %

Kopovidon 3-4 %

Mikrokrystallinsk cellulose 26-28 %

Natriumstivelseglykolat 3-5 %

Magnesiumstearat 0,5 %

I en utførelsesform er forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse hydrobromidsyresaltet, og passende tabletter kan sammensettes som følger: HBr-salt 3-8 %

Vannfri kalsiumhydrogenfosfat 35-45 %

Maisstivelse 15-25 %

Kopovidon 2-6 %

Mikrokrystallinsk cellulose 20-30 %

Natriumstivelseglykolat 1-3 %

Talk 2-6 %

Magnesiumstearat 0,5-2 %

Spesielt kan tablettene sammensettes som følger:

HBr-salt ca. 5 %

Vannfri kalsiumhydrogenfosfat ca. 39 %

Maisstivelse ca. 20 %

Kopovidon ca. 3 %

Mikrokrystallinsk cellulose ca. 25 %

Natriumstivelseglykolat ca. 3 %

Talk ca. 4 %

Magnesiumstearat ca. 1 %

Tabletter med ulike mengder av aktiv forbindelse, slike som tilsvarer f. eks 2,5, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60 eller 80 mg av den frie basen kan oppnås ved å velge den riktige mengden av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse i kombinasjon med en tablett av passende størrelse.

Størrelsen på krystallene som anvendes for å fremstille tabletter som omfatter forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er av betydning. Hvis krystallene er for små, kan de klebe til stempelet i tablettmaskinene. På den annen side, kan de heller ikke være for store. Oppløsningshastigheten i tarmene synker når krystallstørrelsen øker. Hvis krystallene er for store, kan det derfor kompromittere biotilgjengeligheten av forbindelsene. Partikkelstørrelsesfordeling kan beskrives ved å anvende kvantiler, f. eks. D5 %, D10 %, D50 %, D90 %, D95 % og D98 %. Som anvendt heri betyr ” Partikkelstørrelsesfordeling” den kumulative volum størrelsesfordelingen av ekvivalente sfæriske diametre som bestemt ved laserdiffraksjon ved 1 bars dispersivt trykk målt med Sympatec Helos-utstyr.

I en utførelsesform har krystallene av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse og spesielt i betaformen av hydrobromidsyresaltet en partikkelstørrelsesfordeling som tilsvarer D98 %: 650-680 µm; D50 %: 230-250 µm og D5 %: 40-60 µm. I en ytterligere utførelsesform tilsvarer D98 %: 370-390; D50 %: 100-120µm; D5 %: 5-15 µm. I enda en ytterligere utførelsesform, tilsvarer partikkelstørrelsesfordelingen D98 %: 100-125 µm; D50 %: 15-25 µm og D5 %: 1-3 µm. I enda en ytterligere utførelsesform, tilsvarer partikkelstørrelsesfordelingen D98 %: 50-70 µm; D50 %: 3-7 µm og D5 %: 0,5-2.

Den frie basen ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles som beskrevet i WO 2003/029232. Salter ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved å løse den frie basen i et passende løsningsmiddel, tilsette den relevante syren etterfulgt av presipitasjon. Presipitasjon kan oppnås enten ved å tilsette et andre løsningsmiddel og/eller ved inndamping og/eller avkjøling. Alternativt kan den frie basen ifølge foreliggende oppfinnelse og endelig forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse syntetiseres i en palladiumkatalysert reaksjon som beskrevet nedenfor.

Dannelse av aromatiske karbon-heteroatombindinger kan oppnås ved nukleofil aromatisk substitusjon eller kobbermedierte Ullman-reaksjoner. Nylig er det vist at palladium er en kraftig katalysator for dannelsen av slike bindinger og spesielt dannelsen av C-N- og C-S-bindinger, se f. eks. US 5,573,460.

I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av

der fremgangsmåten omfatter å reagere forbindelse II

hvori R’ representerer hydrogen eller et monovalent metallion med en forbindelse med formel III

hvori X₁ og X₂ uavhengig representerer halogen, og en forbindelse med formel IV

hvori R representerer hydrogen eller en beskyttelsesgruppe, i nærvær av et løsningsmiddel, en base og en palladiumkatalysator som består av en palladiumkilde og en fosfinligand ved en temperatur mellom 60 °C og 130 °C.

I en utførelsesform deles fremgangsmåten i underprosesser hvori forbindelse II og forbindelse III reageres i en første reaksjon for å gi en forbindelse med formelen

.

Denne forbindelsen renses deretter eventuelt i en passende grad før den reageres med forbindelse IV for å gi 4-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin.

”Onepot”-synteser, dvs. synteser hvori alle reaktantene blandes sammen ved begynnelsen av reaksjonen eller prosessen er spesielt nyttige på grunn av deres iboende enkelhet. På den annen side økes antallet mulige uønskete bireaksjoner dramatisk, hvilket igjen betyr at antallet og/eller mengden av uønskede biprodukter kan øke, og utbyttet av det ønskede produkt minsker tilsvarende. Spesielt for den foreliggende prosessen kan det observeres at piperazin har to nitrogener som hvert især potensielt kan delta i dannelsen av en C-N-binding. Man har overraskende funnet at foreliggende prosess kan utføres som en onepot-syntese, dvs. en prosess hvori forbindelse II, forbindelse III og forbindelse IV blandes fra begynnelsen og samtidig opprettholde et høyt utbytte av en ren forbindelse.

Forbindelse II er en tiol eller det tilsvarende tiolat. Fra et yrkesmedisinsk perspektiv kan det være fordelaktig å anvende et tiolat slik som Li⁺-, Na⁺- eller K⁺-tiolat for å unngå luktproblemer assosiert med tioler. Ikke desto mindre er R’ i en utførelsesform hydrogen.

Forbindelse III er et 1,2-dihalogenaktivert benzen, og halogenene kan være enhver av Cl, Br og I. Spesielt er forbindelse II 1-brom-2-jod-benzen eller 1,2-dibrom-benzen.

Løsningsmidlet som anvendes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan velges fra aprotiske organiske løsningsmidler eller blandinger av slike løsningsmidler med en koketemperatur innenfor reaksjonens temperaturområde, dvs. 60-130 °C. Løsningsmidlet velges typisk fra toluen, xylen, trietylamin, tributylamin, dioksan, N-metylpyrrolidon eller fra en hvilken som helst blanding derav. Spesielt nevnes toluen som løsningsmiddel.

Sentralt for foreliggende prosess er anvendelsen av en palladiumkatalysator uten hvilken reaksjonene ikke finner sted. Palladuimkatalysatoren består av en palladiumkilde og en fosfinligand. Nyttige palladiumkilder inkluderer palladium i ulike oksidasjonsstilstander, slik som f. eks.0 og II. Eksempler på palladiumkilder som kan anvendes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er Pd₂dba₃, Pddba₂ og Pd(OAc)₂. dba er forkortelse for dibenzylidenaceton. Spesielt nevnes Pddba₂ og Pd₂dba₃. Palladiumkilden benyttes typisk i en mengde på 0,1-10 mol%, slik som 1-10 mol% og slik som 1-5 mol%. Gjennom denne beskrivelsen er mol% beregnet med hensyn til den begrensende reaktanten.

Mange fosfinligander er kjente, både monodentate og bidentate. Nyttige fosfinligander inkluderer racemisk 2,2’-bis-difenylfosfanyl[1,1’]binaftalenyl (rac-BINAP), 1,1’-bis(difenylfosfino)ferrocen (DPPF), bis-(2-difenylfosfinofenyl)eter (DPEphos), tri-t-butyl-fosfin (Fu’s salt),

bifenyl-2-yl-di-t-butyl-fosfin, bifenyl-2-yl-dicykloheksyl-fosfin,

(2’-dicykloheksylfosfanyl-bifenyl-2-yl)-dimetylamin,

[2’-(di-t-butyl-fosfanyl)-bifenyl-2-yl]-dimetylamin og

dicykloheksyl-(2’,4’,6’-tri-propyl-bifenyl-2-yl)-fosfan. Videre kan karbenligander slik som f. eks. 1,3-bis-(2,6-di-isopropyl-fenyl)-3H-imidazol-1-ium; klorid anvendes i stedet for fosfinligander. I en utførelsesform er fosfinliganden rac-BINAP, DPPF eller DPEphos, og spesielt rac-BINAP. Fosfinliganden anvendes vanligvis i en mengde på mellom 0,1 og 10 mol%, slik som 1 og 5 mol% og typisk rundt 1-2 mol%.

Base settes til reaksjonsblandingen for å øke pH. Spesielt er baser valgt fra NaOt-Bu, KOt-Bu og Cs₂CO₃ nyttige. Organiske baser, slik som 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU) og 1,4-diazabicyklo[2,2.2]oktan (DABCO) kan også anvendes. Spesielt nevnes NaO(t-Bu) og KO(t-Bu). Typisk tilsettes basen i en mengde rundt 1-5 ekvivalenter, slik som 1-3 ekvivalenter og slik som 2-3 ekvivalenter.

Forbindelse IV er en piperazinforbindelse. Piperazin har to nitrogener, hvorav bare ett skal delta i dannelsen av C-N-bindingen. I en utførelsesform unngås dannelsen av bindinger til det andre nitrogenet ved å anvende et monobeskyttet piperazin, dvs. en utførelsesform hvori R er en beskyttelsesgruppe. Mange beskyttelsesgrupper er kjent i faget, og nyttige eksempler inkluderer boc, Bn, Cbz, C(=O)O og Me, og spesielt boc. Bn er forkortelse for benzyl; boc er forkortelse for tbutyloksykarbonyl; og cbz er forkortelse for benzyloksykarbonyl. Hvis et beskyttet piperazin anvendes i reaksjonene, må beskyttelsesgruppen fjernes i et etterfølgende trinn, typisk ved tilsetting av vandig syre. Hvis metyl anvendes som beskyttelsesgruppe, kan metylet fjernes i en reaksjon med karbamat og etterfølgende fjerning av denne gruppen.

det har overraskende blitt funnet at ubeskyttet piperazin også kan anvendes uten dannelsen av uønskede bindinger til det andre nitrogenet. Beskyttet og ubeskyttet piperazin har ulik løselighet i ulike løsningsmidler, et eksempel er at piperazin er praktisk talt uløselig i toluen mens boc-beskyttet piperazin er svært løselig i toluen. Normalt vil det forventes at et krav til en vellykket reaksjon er at alle reaktanter er lett løselige i det anvendte løsningsmidlet. Ikke desto mindre har man funnet at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse gir et høyt utbytte med toluen som løsningsmiddel og med ubeskyttet piperazin, dvs. i en utførelsesform hvori R er hydrogen. I en utførelsesform er løsningsmidlet derfor toluen ,og forbindelse IV er piperazin. I en annen utførelsesform anvendes denne kombinasjonen av betingelser i en onepot-syntese.

I en utførelsesform er temperaturen under hvilken prosessen utføres, ca.80 °C – ca.120 °C.

I en utførelsesform fremstilles 1-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)fenyl]-piperazin i en prosess som omfatter følgende trinn:

a. oppløsning eller dispergering av 1-1,5 ekvivalenter av forbindelsene II, III og IV i toluen for å oppnå blanding A;

b. tilsetting av 1-2 mol% Pddba₂ og 1-2 mol% rac-BINAP sammen med 2-3 ekvivalenter NaOt-Bu, eventuelt dispergert eller oppløst eller dispergert i toluen, til blanding A for å oppnå blanding B, som varmes opp til ca.100 °C inntil forbindelse II og III er fullstendig omdannet, typisk 5-10 timer;

c. økning av temperaturen til blandingen oppnådd i trinn b til ca.120 °C inntil forbindelse IV er fullstendig omdannet, typisk 16-32 timer; og

d. eventuelt fjerning av beskyttelsesgruppen ved tilsetting av vandig syre dersom forbindelse III er et beskyttet piperazin.

Eventuelt kan rensingstrinn inkluderes i den ovennevnte sekvens av reaksjonstrinn.

I en utførelsesform dispergerer 1-1,5 ekvivalenter 2,4-dimetyl-tiol, 1-brom-2-jodbenzen (eller 1,2-dibrom-benzen) og piperazin i toluen etterfulgt av tilsetting av 2-5, slik som 3 ekvivalenter NaOt-Bu og 1-2 mol% Pd₂dba₃ og rac-BINAP dispergert i toluen for å oppnå en blanding som reflukseres i 2-10 timer, typisk 3-5 timer for å oppnå 1-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin. Eventuelt kan dette produktet reageres ytterligere med vandig HBr for å oppnå det tilsvarende hydrobromsyreaddisjonssaltet.

I en utførelsesform dispergeres 2-5 ekvivalenter NaOt-Bu, 2-5 ekvivalenter piperazin, 0,2-0,6 mol% Pddba₂ og 0,6-1 mol% rac-BINAP i toluen for å oppnå blanding A’, hvortil tilsettes ca.1 ekvivalent 2-brom-jodbezen for å oppnå blanding B’, hvortil tilsettes 1 ekvivalent 2,4-dimetyltiofenol, og den resulterende blandingen varmes til refluks i 3-7 timer, slik som 4-6 timer for å oppnå 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin. Eventuelt kan dette produktet reageres ytterligere med vandig HBr for å oppnå det tilsvarende hydrobromsyre-addisjonssaltet.

I noen situasjoner kan det være ønskelig å oppnå et syreaddisjonssalt av 1-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin i stedet for den frie basen.

Syreaddisjonssalter kan oppnås i et ytterligere prosesstrinn i hvilket den oppnådde frie basen reageres med en passende syre slik som f. eks. fumarsyre, svovelsyre, saltsyre eller hydrobromsyre. Syren kan tilsettes direkte til reaksjonsblandingen, eller alternativt kan den frie basen renses til enhver passende grad innledningsvis før et slikt trinn. Hvis den frie basen har blitt isolert som en tørr forbindelse, kan det være nødvendig å anvende et løsningsmiddel for å bringe den frie basen i oppløsning før en reaksjon med syren. I en utførelsesform tilsettes vandig hydrobromsyre direkte til reaksjonsblandingen uten noen forutgående rensing av den frie basen.

I prosesser hvori et beskyttet piperazin er blitt anvendt, må beskyttelsesgruppen fjernes ved tilsetting av en vandig syre som forklart ovenfor. I en utførelsesform kan den vandige syren velges for å oppnå to omdannelser, dvs. avbeskyttelsen av det beskyttede piperazinet og dannelsen av et syreaddisjonssalt. Spesielt kan vandig hydrobromsyre anvendes for å avbeskytte beskyttet piperazin og for å oppnå hydrobromsyreaddisjonssaltet i et prosesstrinn.

Det gjelder for alle reaksjonene og reaksjonsblandingene nevnt her at det kan være en fordel å rense dem med en inert gass eller kjøre dem under et teppe av inert gass. Nitrogen er et billig og lett tilgjengelig eksempel på en inert gass.

Anvendelsen av uttrykkene ”en”, ”et”, ”den”, ”det” og ”de” og lignende referenter i sammenhengen med å beskrive oppfinnelsen skal oppfattes å dekke både entalls- og flertallsformer med mindre annet er indikert heri eller klart motsies av sammenhengen. For eksempel skal frasen "indikert" oppfattes som referanse til forskjellige forbindelser ifølge oppfinnelsen eller særskilt beskrevet aspekt dersom ikke noe annet er indikert.

Dersom noe annet ikke er indikert, er alle eksakte verdier gitt heri representative for tilsvarende cirka-verdier (f.eks. kan alle eksakte mønstergyldige verdier angitt med hensyn til en spesiell faktor eller måling også betraktes å gi en tilsvarendecirka-måling modifisert med ”cirka”, hvor det passer).

Beskrivelsen heri av ethvert aspekt eller aspekt av oppfinnelsen som anvender uttrykk slik som ”omfatter”, ”har”, ”inkluderer” eller ”inneholder” med referanse til et eller flere elementer er ment å gi støtte for et lignende aspekt eller aspekt av oppfinnelsen som ”består av”, ”består hovedsakelig av” eller ”hovedsakelig omfatter” det spesielle elementet eller elementene, med mindre noe annet er angitt eller klart motsies av sammenhengen (f.eks. en sammensetning beskrevet heri som omfattende et spesielt element skal forstås som også å beskrive en sammensetning bestående av dette elementet, med mindre noe annet er angitt eller klart motsies av sammenhengen).

Eksempler

Analysemetoder

¹H NMR-spektre opptas ved 500,13 MHz på et Bruker Avance DRX500-instrument. Dimetylsulfoksid (99,8 %D) anvendes som løsningsmiddel, og tetrametylsilan (TMS) anvendes som intern referansestandard.

Smeltepunktene måles ved hjelp av differensialskanningkalorimetri (DSC). Utstyret er et TA-Instruments DSC-Q1000 kalibrert ved 5°/min for å gi smeltepunktet som startverdi. Ca.2 mg prøve varmes 5°/min i en løst lukket panne under nitrogenstrøm. Termogravimetrisk analyse (TGA) anvendt til estimering av løsningsmiddel/vanninnhold i tørket materiale utføres ved hjelp av et TA-instruments TGA-Q500. 1-10 mg prøve varmes 10°/min i en åpen panne under nitrogenstrøm.

Røntgenpulverdiffraktogrammer (XRPD) ble målt på et PANalytical X’Pert PRO X-Ray Diffractometer ved anvendelse av CuKa₁-stråling. Prøvene ble målt i refleksjonsmodus i 2q-området 5-40 ° ved anvendelse av en X’celerator-detektor.

Eksempel 1 In vitro-reseptorfarmakologi

Serotonintransportør fra rotter: IC₅₀5,3 nM (blokkering av 5-HT-opptak) Human serotonintransportør : IC₅₀40 nM (blokkering av 5-HT-opptak)

Human 5-HT_1A-reseptor: K_i 40 nM med delvis agonisme (effektivitet 85 %)

5-HT₃-reseptor fra rotter: IC₅₀0,2 nM (antagonisme i funksjonelt assay)

Human 5-HT_3A-reseptor: IC₅₀ rundt 20 nM (antagonisme i funksjonelt assay). Ved høyere konsentrasjon foreviser forbindelsen agonistisk aktivitet med en ED₅₀ på 2,1 µM. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen viste også høy affinitet for den humane 5HT3-reseptoren i et in vitro-bindingsassay (Ki 4,5 nM).

Eksempel 2 kognitive effekter

Som drøftet ovenfor interagerer forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse med det kolinerge systemet, og det forventes å se en effekt i en eller flere av følgende in vivomodeller.

· Femvalgs seriereaksjonstidstest (5-CSRT), som er nyttig for å vise en effekt på kontinuerlig oppmerksomhet

· Romlig Y-labyrinttest, som er nyttig for å vise effekter på korttids-, langtidsog arbeidsminne

· Modell for "set shifting" av oppmerksomhet, noe som er nyttig for å vise effekter på utføringsfunksjonsevne, dvs. resonnering og problemløsing

Eksempel 3a Fremstilling av fri base av forbindelse I

10 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-hydrobromid ble behandlet med en omrørt blanding av 100 ml 3 M NaOH og 100 ml etylacetat i 10 minutter. Den organiske fasen ble separert, vasket med 100 ml 15 vektprosent NaCl (aq), tørket over MgSO₄, filtrert og konsentrert i vakuum for å frembringe 7,7 gram (98 %) av forbindelse I base som en klar, fargeløs olje.

NMR samsvarer med struktur.

Eksempel 3b Fremstilling av krystallinsk base av forbindelse I

3,0 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin fargeløs olje ble behandlet med 70 ml acetonitril og varmet til refluks. Den nesten klare løsningen ble filtrert og det klare filtratet ble avkjølt spontant hvorved presipitasjon begynte kort tid etter filtrering. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur (22 °C) i 2 timer, og produktet ble isolert ved filtrering og tørket i vakuum (40 °C) over natten. Den krystallinske basen ble isolert som et hvitt, fast stoff i 2,7 gram (90 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 72,40 % C, 9,28 % N, 7,58 % H (teoretisk: 72,26 % C, 9,36 % N, 7,42 % H)

Eksempel 3c Karakterisering av krystallinsk base av forbindelse I Basen, som fremstilt i eksempel 3b, er krystallinsk (XRPD) – se figur 1. Den har et smeltepunkt på ~117 °C. Den er ikke hygroskopisk og har en løselighet på 0,1 mg/ml i vann.

Eksempel 4a Fremstilling av alfaformen av hydrobromidsaltet av forbindelse I 2,0 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin ble løst i 30 ml varm etylacetat og tilsatt 0,73 ml 48 vektprosent HBr (aq). Denne tilsettingen forårsaket dannelse av en tykk slurry og ytterligere 10 ml etylacetat ble tilsatt for å få til ordentlig omrøring. Slurryen ble omrørt ved romtemperatur i en time. Filtrering og tørking i vakuum (20 °C) over natten frembrakte 2,0 gram av produktet som et hvitt, fast stoff (80 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 57,05 % C, 7,18 % N, 6,16 % H (Teoretisk for 1:1-salt: 56,99 % C, 7,39 % N, 6,11 % H)

Eksempel 4b Karakterisering av alfaformen av hydrobromidet av forbindelse I Alfaformen av hydrobromidet, som fremstilt i eksempel 4a, er krystallinsk (XRPD) -se figur 2. Den har et smeltepunkt på ~226 °C. Den absorberer ca.0,3 % vann når den utsettes for høy relativ fuktighet og har en løselighet på 2 mg/ml i vann.

Eksempel 4c Fremstilling av betaformen av hydrobromidsaltet av forbindelse I 49,5 gram fargeløs 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazinolje ble løst i 500 ml etylacetat og tilsatt 18,5 ml 48 vektprosent HBr (aq). Denne tilsettingen forårsaket dannelse av en tykk slurry hvilken ble omrørt over natten ved romtemperatur. Filtrering og tørking i vakuum (50 °C) over natten frembrakte produktet i 29,6 gram som hvitt, fast stoff (47 %).

NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 56,86 % C, 7,35 % N, 6,24 % H (Teoretisk for 1:1 salt: 56,99 % C, 7,39 % N, 6,11 % H)

Eksempel 4d Karakterisering av betaformen av hydrobromidet av forbindelse I Betaformen av hydrobromidet, som fremstilt i eksempel 4c, er krystallinsk (XRPD) se figur 3. Den har et smeltepunkt på ~231 °C. Den absorberer ca.0,6 % vann når den utsettes for høy relativ fuktighet og har en løselighet på 1,2 mg/ml i vann.

Eksempel 4e Fremstilling av gammaformen av hydrobromidsaltet av forbindelse I 1 g 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-hydrobromid som fremstilt i eksempel 4a ble tilsatt 20 ml vann og varmet til 85 °C. Løsningen var nesten klar. Tilsetting av 1 dråpe HBr gjorde den klar. HBr ble tilsatt inntil blakkingspunktet ble observert. Løsningen ble avkjølt til romtemperatur og tørket. NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 56,63 % C, 7,18 % N, 6,21 % H (Teoretisk for 1:1-salt: 56,99 % C, 7,39 % N, 6,11 % H)

Eksempel 4f Karakterisering av gammaformen av hydrobromidet av forbindelse I Hydrobromidet, som fremstilt i eksempel 6e, er krystallinsk (XRPD) – se figur 4. DSC-kurven viser noen termiske hendelser ved ca.100 °C; sannsynligvis endring i krystallform. Deretter smelter det ved ca.220 °C. Det absorberer ca.4,5 % vann når det utsettes for høy relativ fuktighet og ved 30 % RH ved romtemperatur absorberes ca. 2 % vann.

Eksempel 4 g Fremstilling av hydrobromidhydratet av forbindelse I

1,4 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazinolje ble tilsatt 20 ml vann og varmet til 60 °C. pH ble justert til 1 ved hjelp av 48 % HBr. Løsningen ble avkjølt til romtemperatur og tørket. NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 55,21 % C, 7,16 % N, 6,34 % H (Teoretisk for 1:1 salthemihydrat: 55,68 % C, 7,21 % N, 6,23 % H)

Eksempel 4h Karakterisering av hemihydratet av hydrobromidet av forbindelse I Hydratet som fremstilt i eksempel 4 g er krystallinsk (XRPD) – se figur 5.

Vanninnholdet avhenger sterkt av den relative fuktigheten. Ved romtemperatur og 95 % RH er vanninnholdet ca.3,7 %. Dehydrering skjer ved oppvarming til ca.100 °C.

Eksempel 4i Fremstilling av etylacetatsolvatet av hydrobromidsaltet av forbindelse I 0,9 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazinolje ble løst i 35 ml etylacetat og tilsatt 0,5 ml 48 vektprosent HBr (aq). Denne tilsettingen forårsaket dannelse av en tykk slurry, som ble omrørt over natten ved romtemperatur. Filtrering og vasking med 30 ml dietyleter etterfulgt av tørking i vakuum (50 °C) over natten frembrakte 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-HBr-EtOAc-solvat i 1,0 gram (65 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 56,19 % C, 6,60 % N, 6,56 % H (teoretisk for 1:1-salt etter korreksjon for 8 % etylacetat og 0,5 % vann som bestemt ved TGA og KF: 56,51 % C, 6,76 % N, 6,38 % H)

Eksempel 4j Karakterisering av etylacetatsolvatet av hydrobromidet av forbindelse I Etylacetatsolvatet, som fremstilt i eksempel 4i, er krystallinsk (XRPD) – se figur 6. Batchen inneholder en blanding av solvatet og alfaformen av forbindelse I, sannsynligvis fordi tørkingen har forårsaket delvis desolvatering. Desolvateringen starter ved ~75 °C ved oppvarming 10°/min. Etter desolvatering dannes alfaformen. Ved eksponering for høy relativ fuktighet, erstattes etylacetat av vann, som avgis når fuktigheten deretter senkes. Det resulterende faste stoffet er hygroskopisk og absorberer 3,2 % vann ved høy relativ fuktighet.

Eksempel 5a Fremstilling av hydrokloridsalt av forbindelse I

1,0 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazinolje ble løst i 20 ml etylacetat ved forsiktig oppvarming (30 °C). Da en klar løsning ble oppnådd, ble en løsning av 2 M HCl i dietyleter langsomt tilsatt inntil pH var ca.1-2. Under tilsettingen ble spontan presipitasjon observert. Etter endelig tilsetting ble suspensjonen omrørt i 1 time før det hvite presipitatet ble isolert ved filtrering og tørket i vakuum (40 °C) over natten.1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-hydroklorid ble isolert i 1,1 gram (99 %).

NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 64,18 % C, 8,25 % N, 6,96 % H (Teoretisk for 1:1-salt etter korreksjon for 0,66 % vann som bestemt ved TGA: 64,13 % C, 8,31 % N, 6,95 % H)

Eksempel 5b Karakterisering av hydrokloridet av forbindelse I

Hydrokloridet, som fremstilt i eksempel 5a, er krystallinsk (XRPD) – se figur 7. Det har et smeltepunkt på ~236 °C. Det absorberer ca.1,5 % vann når det utsettes for høy relativ fuktighet og har en løselighet på 3 mg/ml i vann.

Eksempel 5c Fremstilling av hydrokloridmonohydratet av forbindelse I

11,9 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazinolje ble løst i 100 ml etanol ved oppvarming. Da en homogen løsning ble oppnådd, fant tilsetting av 3,5 ml kons. HCl (aq) sted, noe som forårsaket umiddelbar presipitasjon av et hvitt, fast stoff. Suspensjonen ble først omrørt i 5 minutter og deretter i isbad en time til før filtrering. Det hvite faste stoffet ble vasket med 100 ml frisk, kald etanol (plassert i fryser ved – 18 °C i 2 timer), 50 ml aceton og til slutt 50 ml dietyleter før tørking i vakuum (50 °C) over natten.1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-HCl ble isolert i 5,1 gram (38 %).

NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 61,23 % C, 7,91 % N, 7,16 % H (Teoretisk for 1:1-salt monohydrat: 61,26 % C, 7,94 % N, 7,14 % H)

Eksempel 5d Karakterisering av hydrokloridmonohydratet av forbindelse I Hydrokloridmonohydratet, som fremstilt i eksempel 5c, er krystallinsk (XRPD) – se figur 8. Det dehydrerer startende ved ca.50 °C. Noen termiske hendelser, sannsynligvis omleiring, inntreffer ved ytterligere oppvarming, og det smelter ved ca.

230 °C etterfulgt av omkrystallisering og smelting ved ca.236 °C. Det absorberer ikke ytterligere mengder vann når det utsettes for høy relativ fuktighet, og det hydratbundne vannet frigis ikke før den relative fuktigheten er sunket under 10 % RH ved romtemperatur. Det har en løselighet på ca.2 mg/ml i vann.

Eksempel 6a Fremstilling av mesylatsalt av forbindelse I

1,0 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazinolje ble løst i 20 ml etylacetat ved oppvarming (70 °C). Da en klar løsning ble oppnådd, ble 0,35 gram metansulfonsyre (1,1 ekv.) langsomt tilsatt. Etter endelig tilsetting ble løsningen avkjølt på is og dietyleter ble langsomt tilsatt og forårsaket presipitasjon av produktet. Suspensjonen ble omrørt i 2 timer på is før det hvite presipitatet ble isolert ved filtrering og tørket i vakuum (40 °C) over natten.1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-mesylat ble isolert i 1,1 gram (85 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 57,81 % C, 6,81 % N, 6,68 % H (Teoretisk for et 1:1-salt: 57,81 % C, 7,10 % N, 6,64 % H)

Eksempel 6b Karakterisering av mesylatet av forbindelse I

Mesylatet, som fremstilt i eksempel 7a, er krystallinsk (XRPD) – se figur 9. Det har et smeltepunkt på ~163 °C. Det er hygroskopisk (absorberer ca.8 % vann når det utsettes for 80 % relativ fuktighet) og omdannes derved til en hydrert form. De siste 6 % av det absorberte vannet frigis ikke før den relative fuktigheten er under 10 % RH. Det har et svært høy løselighet i vann (>45 mg/ml).

Eksempel 7a Fremstilling av fumarat av forbindelse I

5,5 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazinolje ble varmet til refluks i en blanding av 50 ml metanol og 50 ml etylacetat. Løsningen ble hensatt for å avkjøle noe før tilsetting av 2,1 gram fumarsyre fant sted og forårsaket en eksoterm reaksjon og presipitasjon av et hvitt, fast stoff. Suspensjonen ble omrørt mens den ble avkjølt til romtemperatur etterfulgt av 2 timer i fryser ved –18 °C. Det hvite faste stoffet ble samlet ved filtrering og vasket med 20 ml kald etylacetat før tørking i vakuum (50 °C) over natten. Produktet ble isolert i 3,1 gram (44 %).

NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 63,42 % C, 6,64 % N, 6,42 % H (Teoretisk for et 1:1-salt: 63,74 % C, 6,76 % N, 6,32 % H)

Eksempel 7b Karakterisering av fumaratet av forbindelse I

Fumaratet, som fremstilt i eksempel 7a, er krystallinsk (XRPD) – se figur 10. Det har et smeltepunkt på ~194 °C. Løseligheten i vann er 0,4 mg/ml.

Eksempel 8a Fremstilling av maleat av forbindelse I

2,5 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazinolje ble løst i 50 ml etylacetat og varmet til 60 °C etterfulgt av tilsetting av 1,1 gram maleinsyre.

Blandingen ble varmet på nytt til refluks i 5 minutter og hensatt for å avkjøle til romtemperatur under omrøring. Under avkjølingen startet presipitasjonen, og denne var fullført etter 4 timer i fryser (-18 °C). Det hvite faste stoffet ble samlet ved filtrering og vasket med 50 ml dietyleter før tørking i vakuum (50 °C) over natten. Dette frembrakte 1,3 gram 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazinmaleat (38 %) som ble omkrystallisert ved behandling med 40 ml etylacetat og 5 ml metanol ved refluks. Den klare løsningen ble avkjølt til romtemperatur etterfulgt av 2 timer i fryser (-18 °C) før filtrering og vasket to ganger med 10 ml kald etylacetat etterfulgt av tørking i vakuum (50 °C) i til dager.1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-maleat ble isolert i 0,9 gram (69 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 63,57 % C, 6,79 % N, 6,39 % H (Teoretisk for et 1:1-salt: 63,74 % C, 6,76 % N, 6,32 % H)

Eksempel 8b Karakterisering av maleatet av forbindelse I

Maleatet, som fremstilt i eksempel 8a, er krystallinsk (XRPD) – se figur 11. Det har et smeltepunkt på ~152 °C. Løseligheten i vann er ~1 mg/ml.

Eksempel 9a Fremstilling av meso-tartrat av forbindelse I

11,1 ml av en 0,30 M løsning av 1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin i aceton ble behandlet med 0,5 gram meso-vinsyre løst i 5 ml aceton. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter under hvilken tid presipitasjon fant sted. Filtrering og vasking først med 5 ml aceton og deretter 3 ml dietyleter frembrakte produktet som et hvitt, fast stoff som ble tørket i vakuum (50 °C) over natten.1-[2-(2,4-dimetyldimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-meso-vinsyre ble isolert i 1,4 gram (93 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 58,58 % C, 6,29 % N, 6,40 % H (Teoretisk for et 1:1-salt: 58,91 % C, 6,25 % N, 6,29 % H)

Eksempel 9b Karakterisering av meso-tartratet av forbindelse I

Meso-tartratet, som fremstilt i eksempel 9a, er krystallinsk (XRPD) – se figur 12. Det har et smeltepunkt på ~164 °C. Løseligheten i vann er ~0,7 mg/ml.

Eksempel 10a Fremstilling av L-(+)-tartrat av forbindelse I

11,1 ml av en 0,30 M løsning av 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin i aceton ble behandlet med 0,5 gram L-(+)-vinsyre løst i 5 ml aceton. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter under hvilken tid presipitasjon fant sted. Filtrering og vasking først med 5 ml aceton og deretter 3 ml dietyleter ga produktet som et hvitt, fast stoff som ble tørket i vakuum (50 °C) over natten. 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-(+)-vinsyre ble isolert i 1,2 gram (81 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 58,86 % C, 6,30 % N, 6,38 % H (Teoretisk for et 1:1-salt: 58,91 % C, 6,25 % N, 6,29 % H)

Eksempel 10b Karakterisering av L-(+)-tartratet av forbindelse I

L-(+)-tartratet, som fremstilt i eksempel 10a, er krystallinsk (XRPD) – se figur 13. Det har et smeltepunkt på ~171°C. Løseligheten i vann er ~0,4 mg/ml.

Eksempel 11a Fremstilling av D-(-)-tartrat av forbindelse I

11,1 ml av en 0,30 M løsning av 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin i aceton ble behandlet med 0,5 gram D-(-)-vinsyre løst i 5 ml aceton. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter under hvilken tid presipitasjon fant sted. Filtrering og vasking først med 5 ml aceton og deretter 3 ml dietyleter ga produktet som et hvitt, fast stoff som ble tørket i vakuum (50 °C) over natten. 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-D-(-)-vinsyre ble isolert i 1,0 gram (68 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 58,90 % C, 6,26 % N, 6,35 % H (Teoretisk for et 1:1-salt: 58,91 % C, 6,25 % N, 6,29 % H)

Eksempel 11b Karakterisering av D-(-)-tartratet av forbindelse I

D-(+)-tartratet, som fremstilt i eksempel 11a, er krystallinsk (XRPD) – se figur 14. Det har et smeltepunkt på ~175 °C. Løseligheten i vann er ~0,4 mg/ml.

Eksempel 12a Fremstilling av sulfat av forbindelse I

11,1 ml av en 0,30 M løsning av 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin i aceton ble behandlet med 2,2 ml av en 3 M løsning av H₂SO₄ (aq). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter og deretter i isbad i ytterligere 4 timer før presipitasjon fant sted og ble fullført. Filtrering og vasking først med 5 ml aceton og deretter 3 ml dietyleter gaproduktet som et hvitt, fast stoff som ble tørket i vakuum (50 °C) over natten.1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-sulfat ble isolert i 0,51 gram (39 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 54,53 % C, 7,22 % N, 6,28 % H (Teoretisk for et 1:1-salt: 54,52 % C, 7,07 % N, 6,10 % H) Eksempel 12b Karakterisering av sulfatet av forbindelse I

Sulfatet, som fremstilt i eksempel 12a, er krystallinsk (XRPD) – se figur 15. Det har et smeltepunkt på ~166 °C. Løseligheten i vann er ~0,1 mg/ml.

Eksempel 13a Fremstilling av fosfat av forbindelse I

11,1 ml av en 0,30 M løsning av 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin i aceton ble behandlet med 0,2 ml 65 % H₃PO₄ (aq). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter under hvilken tid presipitasjon fant sted. Filtrering og vasking først med 5 ml aceton og deretter 3 ml dietyleter ga produktet som et hvitt, fast stoff som ble tørket i vakuum (50 °C) over natten.1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin-fosfat ble isolert i 1,23 gram (94 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 54,21 % C, 7,15 % N, 6,43 % H (teoretisk for et 1:1-salt: 54,53 % C, 7,07 % N, 6,36 % H)

Eksempel 13b Karakterisering av fosfatet av forbindelse I

Fosfatet, som fremstilt i eksempel 13a, er krystallinsk (XRPD) -se figur 16. Det har et smeltepunkt på ~224 °C. Løseligheten i vann er ~1 mg/ml.

Eksempel 14a Fremstilling av nitrat av forbindelse I

11,1 ml av en 0,30 M løsning av 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazin i aceton ble behandlet med 0,2 ml 16,5 M HNO₃ (aq). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter under hvilken tid presipitasjon fant sted. Filtrering og vasking først med 5 ml aceton og deretter 3 ml dietyleter ga produktet som et hvitt, fast stoff som ble tørket i vakuum (50 °C) over natten.1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]piperazinnitrat ble isolert i 0,87 gram (73 %). NMR samsvarer med struktur. Elementanalyse: 59,80 % C, 11,67 % N, 6,51 % H (Teoretisk for et 1:1-salt: 59,81 % C, 11,63 % N, 6,41 % H)

Eksempel 14b Karakterisering av nitratet av forbindelse I

Nitratet, som fremstilt i eksempel 14a, er krystallinsk (XRPD) – se figur 17. Det smelter ikke, men dekomponerer under en eksoterm reaksjon ved ca.160 °C.

Løseligheten i vann er ~0,8 mg/ml.

Eksempel 15 Tablett

Eksemplene under viser representative eksempler på hvordan tabletter som omfatter forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles. Betaformen av hydrobromidsaltet er blitt anvendt i alle eksemplene.

Eksempel 15a

63,55 g av hydrobromidsaltet, 923,65 g Lactosum 350M, 461,8 g maisstivelse og 76,0 g Kollidon VA64 ble blandet i 2 minutter i en Diosna PP1 høyskjærsblander ved en rørevingehastighetrørevingehastighet på 1000 rpm. Deretter ble rørevingehastighetrørevingehastigheten senket til 800 rpm, og 220 g vann ble tilsatt i løpet av et minutt. Knaing ble utført i 7 minutter og de resulterende granulene ble passert gjennom en siktsikt, størrelse 4000 µm. Granulene ble tørket og passert gjennom en siktsikt, størrelse 710 µm. 1383,5 g av de resulterende granulene ble blandet med 400 g Avicel PH200 og 60 g Ac-Di-Sol. Etter smøring av blandingen ved blanding blanding med 15 g magnesiumstearat ble pulverblandingen overført til en tablettpresse. Tabletter med en målkjernevekt på 200 mg og en diameter på 8 mm ble fremstilt for å oppnå tabletter med et målinnhold tilsvarende 5 mg fri base.

Eksempel 15b

317,75 g av hydrobromidsaltet, 754,15 g Lactosum 350M, 377,1 g maisstivelse og 76,0 g Kollidon VA64 ble blandet i 2 minutter i en Diosna PP1 høyskjærsblander ved en rørevingehastighetrørevingehastighet på 1000 rpm. Deretter ble rørevingehastighetrørevingehastigheten senket til 800 rpm, og 210 g vann ble tilsatt i løpet av et minutt. Knaing ble utført i 7 minutter og de resulterende granulene ble passert gjennom en siktsikt, størrelse 4000 µm. Granulene ble tørket og passert gjennom en siktsikt, størrelse 710 µm. 1386,2 g av de resulterende granulene ble blandet med 400 g Avicel PH200 og 60 g Ac-Di-Sol. Etter smøring av blandingen ved blanding blanding med 15 g magnesiumstearat ble pulverblandingen overført til en tablettpresse. Tabletter med en målkjernevekt på 200 mg og en diameter på 8 mm ble fremstilt for å oppnå tabletter med et målinnhold tilsvarende 25 mg fri base.

Eksempel 15c

32,2 g av hydrobromidsaltet, 944,82 g Lactosum 350M, 472,4 g maisstivelse og 76,0 g Kollidon VA64 ble blandet i 2 minutter i en Diosna PP1 høyskjærsblander ved en rørevingehastighetrørevingehastighet på 1000 rpm. Deretter ble rørevingehastighetrørevingehastigheten senket til 800 rpm, og 220 g vann ble tilsatt i løpet av et minutt. Knaing ble utført i 7 minutter og de resulterende granulene ble passert gjennom en siktsikt, størrelse 4000 µm. Granulene ble tørket og passert gjennom en siktsikt, størrelse 710 µm. 1317 g av de resulterende granulene ble blandet med 400 g Avicel PH200 og 60 g Ac-Di-Sol. Etter smøring av blandingen ved blanding blanding med 15 g magnesiumstearat ble pulverblandingen overført til en tablettpresse. Tabletter med en målkjernevekt på 208 mg og en diameter på 8 mm ble fremstilt for å oppnå tabletter med et målinnhold tilsvarende 2,5 mg av den frie basen.

Eksempel 15d

540,85 g av hydrobromidsaltet, 953,00 g Pearlitol 50C, 296,22 g maisstivelse og 70,5 g Kollidon VA64 ble blandet i 2 minutter i en Aeromatic-Fielder PMA1 høyskjærsblander ved en rørevingehastighetrørevingehastighet på 1000 rpm. Deretter ble rørevingehastigheten senket til 800 rpm, og 241,87 g vann ble tilsatt i løpet av et minutt. Knaing ble utført i 7 minutter og de resulterende granulene ble passert gjennom en sikt, størrelse 4000 µm. Granulene ble tørket og passert gjennom en sikt, størrelse 710 µm. 1500 g av de resulterende granulene ble blandet med 531,91 g Avicel PH200 og 85,11 g Primojel. Etter smøring av blandingen ved blanding blanding med 10,64 g magnesiumstearat ble pulverblandingen overført til en tablettpresse. Tabletter med en målkjernevekt på 125 mg og en diameter på 6 mm ble fremstilt for å oppnå tabletter med et målinnhold tilsvarende 25 mg fri base.

Eksempel 15e

270,45 g av hydrobromidsaltet, 772,0 g Pearlitol 50C, 386,41 g maisstivelse og 70,5 g Kollidon VA64 ble blandet i 2 minutter i en Aeromatic-Fielder PMA1 høyskjærsblander ved en rørevingehastighet på 1000 rpm. Deretter ble rørevingehastigheten senket til 800 rpm, og 195 g vann ble tilsatt i løpet av et minutt. Knaing ble utført i 5,5 minutter og de resulterende granulene ble passert gjennom en sikt, størrelse 4000 µm. Granulene ble tørket og passert gjennom en sikt, størrelse 710 µm. 1200,3 g av de resulterende granulene ble blandet med 425,5 g Avicel PH200 og 68,09 g Primojel. Etter smøring av blandingen ved blanding med 8,8 g magnesiumstearat ble pulverblandingen overført til en tablettpresse. Tabletter med en målkjernevekt på 100 og en diameter på 6 mm ble fremstilt for å oppnå tabletter med et målinnhold tilsvarende 10 mg fri base.

Eksempel 15f

504,85 g av den fri basen, 552,95 g Pearlitol 50C, 276,53 g maisstivelse og 65,7 g Kollidon VA64 ble blandet i 2 minutter i en Aeromatic-Fielder PMA1 høyskjærsblander ved en rørevingehastighet på 1000 rpm. Deretter ble rørevingehastigheten senket til 800 rpm, og 182 g vann ble tilsatt i løpet av et minutt. Knaing ble utført i 5,5 minutter og de resulterende granulene ble passert gjennom en sikt, størrelse 4000 µm. Granulene ble tørket og passert gjennom en sikt, størrelse 710 µm. 1250,7 g av de resulterende granulene ble blandet med 443,31 g Avicel PH200 og 70,8 g Primojel. Etter smøring av blandingen ved blanding med 8,92 g magnesiumstearat ble pulverblandingen overført til en tablettpresse. Tabletter med en målkjernevekt på 250 mg og en diameter på 8 mm ble fremstilt for å oppnå tabletter med et målinnhold tilsvarende 50 mg fri base.

Eksempel 15g

135,23 g av hydrobromidsaltet, 863,2 g Pearlitol 50C, 432,69 g maisstivelse og 70,66 g Kollidon VA64 ble blandet i 2 minutter i en Aeromatic-Fielder PMA1 høyskjærsblander ved en rørevingehastighet på 1000 rpm. Deretter ble rørevingehastigheten senket til 800 rpm, og 195 g vann ble tilsatt i løpet av et minutt. Knaing ble utført i 5,5 minutter og de resulterende granulene ble passert gjennom en sikt, størrelse 4000 µm. Granulene ble tørket og passert gjennom en sikt, størrelse 710 µm. 1200 g av de resulterende granulene ble blandet med 425,28 g Avicel PH200 og 68,2 g Primojel. Etter smøring av blandingen ved blanding med 8,58 g magnesiumstearat ble pulverblandingen overført til en tablettpresse. Tabletter med en målkjernevekt på 100 mg og en diameter på 6 mm ble fremstilt for å oppnå tabletter med et målinnhold tilsvarende 5 mg fri base.

Eksempel 15h

67,6 g av hydrobromidsaltet, 908,0 g Pearlitol 50C, 453,9 g maisstivelse og 70,51 g Kollidon VA64 ble blandet i 2 minutter i en Diosna PP1 høyskjærsblander ved en rørevingehastighet på 1000 rpm. Deretter ble rørevingehastigheten senket til 800 rpm, og 195 g vann ble tilsatt i løpet av et minutt. Knaing ble utført i 5,5 minutter og de resulterende granulene ble passert gjennom en sikt, størrelse 4000 µm. Granulene ble tørket og passert gjennom en sikt, størrelse 710 µm.1325 g av de resulterende granulene ble blandet med 531,91 g Avicel PH200 og 85,11 g Primojel. Etter smøring av blandingen ved blanding med 10,64 g magnesiumstearat ble pulverblandingen overført til en tablettpresse. Tabletter med en målkjernevekt på 207,8 mg og en diameter på 7 mm ble fremstilt for å oppnå tabletter med et målinnhold tilsvarende 5 mg fri base.

Eksempel 15i

2290,1 g av hydrobromidsaltet, 17568 g vannfri kalsiumhydrogenfosfat og 8783 g maisstivelse og 1510 g kopovidon ble blandet i 3 minutter i en Aeromatic-Fielder PMA100 høyskjærsblander ved en rørevingehastighet på 200 rpm. Deretter ble 5130 g vann ble tilsatt i løpet av 2 minutter ved en rørevingehastighet på 150 rpm. Knaing ble utført i 15 minutter og de resulterende granulene ble passert gjennom en kjeglemølle drevet ved ca.2700 rpm med en sikt med størrelse 9,525 mm. Granulene ble tørket og passert gjennom kjeglemølle drevet ved ca.1500 rpm med en sikt med størrelse 2,388 mm. 28747 g av de resulterende granulene ble blandet med 11250 g mikrokrystallinsk cellulose, 1350 g natriumstivelseglykolat (type A) og 1800 g talk. Etter smøring av blandingen ved blanding med 450 g magnesiumstearat ble pulverblandingen overført til en tablettpresse. Tabletter med en målkjernevekt på 125 mg og en diameter på 6 mm ble fremstilt for å oppnå tabletter med et målinnhold av hydrobromidsaltet tilsvarende 5 mg av den fri basen. I tillegg ble tabletter med en målkjernevekt på 250 mg og en diameter på 8 mm fremstilt for å oppnå tabletter med et målinnhold av hydrobromidsaltet tilsvarende 10 mg av den fri basen.

Eksempel 16 Smerteeffekter i intradermal formalintest på mus

I denne modellen mottar mus en formalininjeksjon (4,5 %, 20 µl) i venstre bakpote. Irritasjonen forårsaket av formalininjeksjonen fremkaller en karakteristisk bifasisk atferdsrespons som kvantifiseres ved hvor mye tid som medgår til å slikke den skadde poten. Den første fasen (~0-10 minutter) representerer direkte kjemisk irritasjon og nocisepsjon, mens den andre (~20-30 minutter) er tenkt å representere smerte av nevropatisk opprinnelse. De to fasene atskilles av en hvileperiode der atferden går tilbake til det normale. Effektiviteten av testforbindelsene mht. reduksjon av de smertefulle stimuliene vurderes ved å beregne tiden brukt til å slikke den skadde poten i de to fasene.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse viste en signifikant reduksjon i smerteskårer i andre fase (figur 18b), noe som indikerer virkning mot smerte av nevroptatisk opprinnelse. Enn videre viste forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse en signifikant reduksjon i skårer i første fase (figur 18a), noe som indikerer en mer analgetisk virkning ved den høyeste dosen. I korte trekk indikerer disse resultatene at forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse sannsynligvis vil være effektive i behandlingen av smertelidelser.

Eksempel 17

20 g 2-bromjodbenzen (71 mmol) og 9,8 g 2,4-dimetyltiofenol (71 mmol) ble løst i 100 ml toluen. Løsningen ble renset med nitrogen før 324 mg Pd₂dba₃ (0,35 mmol; 1 mol%) og 381 mg DPEPhos (0,71 mmol; 1 mol%). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 5 min under hvilken tid fargen endres fra mørkerød til oransje. Tilsetting av 8,7 g KOBu^t (78 mmol) fant sted og en heterogen blanding ble dannet umiddelbart.

Suspensjonen ble varmet til 100 °C under nitrogen. Etter 1 time ble blandingen avkjølt til 0 °C og omrørt i 2 timer før filtrering av blandingen gjennom en celitepute. Filterkaken ble vasket med 2 x 50 ml toluen og de kombinerte filtratene inndampet til 21 g av en oransje-rødlig olje (99 % utbytte) som viste seg å være > 96 % ren ved HPLC og GC-MS.

Eksempel 18

500 ml toluen ble plassert i en 1 l trehalset rund kolbe med en mekanisk rører og tilsatt 203 mg Pddba₂ (0,35 mmol; 0,1 mol-%) og 760 mg DPEPhos (1,5 mmol; 0,4 mol-%). Den mørkerøde løsningen ble renset med nitrogen i 5 minutter før tilsetting av 100 g 2-bromjodbenzen (353 mmol) og 48,9 g 2,4-dimetyltiofenol (353 mmol) fant sted. Tilsetting av 43,6 g KOBu^t (389 mmol) forårsaket en eksoterm reaksjon som økte temperaturen fra 20 °C til 36 °C samtidig med dannelsen av heterogen blanding. Suspensjonen ble varmet til 100 °C under nitrogen. Etter 7 timer ble blandingen avkjølt til 0 °C og omrørt i 2 timer før filtrering av blandingen gjennom en celitpute. Filterkaken ble vasket med 2 x 200 ml toluen og de kombinerte filtratene ble inndampet til 104 g av en oransje olje (105 % utbytte) som viste seg å være 97 % ren ved HPLC, og NMR samsvarer med den ønskede strukturen. Oljen størknet under henstand ved romtemperatur.

Eksempel 19

En løsning av 10 gram 1-(2-brom-fenylsulfanyl)-2,4-dimetyl-benzen (34 mmol) i 50 ml tørt toluen ble tilsatt 7 gram boc-piperazin (38 mmol), avgasset med nitrogen i 5 minutter, tilsatt 312 mg Pd₂dba₃ (2 mol%) og 637 mg rac-BINAP (3 mol%), avgasset i ytterligere 5 minutter før tilsetting av 3,9 gram Bu^tONa (41 mmol) og varmet til 80 °C i 15 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til RT og ekstrahert to ganger med 20 ml 15 % saltløsning, tørket over Na₂SO_4, tilsatt tjærekull, refluksert i 15 minutter, filtrert gjennom celite og inndampet til 14,2 gram brunlig olje (4-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-BOC-piperazin) med en renhet på 95 % bestemt ved NMR. Den ubearbeidede oljen ble løst i 200 ml MeOH og 20 ml 6 M HCl (aq.) og refluksert i 1 time hvoretter HPLC viste full avbeskyttelse. Etter avkjøling til RT ble metanolen ble fjernet under vakuum på en rotasjonsinndamper, 20 ml kons. NaOH (pH ble målt til 13-14) ble tilsatt hvoretter blandingen ble omrørt 15 minutter med 100 ml EtOAc. Den organiske fasen ble samlet og ekstrahert to ganger med 30 ml 15 % saltløsning, tørket over Na₂SO₄ og tilsatt 5,2 g fumarsyre (44 mmol) i 30 ml MeOH. Under oppvarming til refluks dannes en homogen løsning fra hvilken en hurtig presipitasjon finner sted enten under ytterligere oppvarming eller etter avkjøling. Presipitatet ble samlet, vasket med 20 ml EtOAc og 20 ml aceton, tørket under vakuum for å gi 9,3 gram 1-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazinfumarat (22 mmol) som et hvitt pulver i 66 % totalt utbytte med en renhet på 99,5 % ved LC-MS.

Eksempel 20

100 g 1,2-dibrombenzen (424 mmol) og 58,6 g 2,4-dimetyltiofenol (424 mmol) løses i 800 ml toluen. Løsningen renses med nitrogen før 4,6 g Pddba₂ (8 mmol; 2 mol%) og 13,1 g rac-BINAP (21 mmol; 5 mol%). Reaksjonsblandingen omrøres 5 min under hvilken tid fargen endres fra mørkerød til oransje. Tilsetting av 61 g NaOBu^t (636 mmol) og 200 ml toluen fant sted og en heterogen blanding ble dannet umiddelbart. Suspensjonen ble varmet til 80 °C under nitrogen. Etter 10 timer avkjøles blandingen til 60 °C før tilsetting av en slurry med 102,6 g boc-piperazin (551 mmol) og ytterligere 61 g NaOBu^t (636 mmol) i 500 ml toluen. Reaksjonsblandingen ble renset med nitrogen før tilsetting av en ytterligere porsjon av 4,6 g Pddba₂ (8 mmol; 2 mol%) og 13,1 g rac-BINAP (21 mmol; 5 mol%). Blandingen ble varmet til refluks denne gang (110 °C) i ytterligere 6 timer eller inntil HPLC viser full omdannelse. Reaksjonsblandingen ble avkjølt på is i 2 timer før filtrering av blandingen gjennom en celitpute. Filterkaken vaskes med 2 x 200 ml toluen og de kombinerte filtratene inndampes til 242 g rød olje. Oljen ble løst i 1000 ml MeOH og langsomt tilsatt 115 ml 48 vektprosent HBr (aq.) etterfulgt av oppvarming til refluks i 2 timer hvoretter full avbeskyttelse ble påvist ved HPLC. Blandingen ble avkjølt, tilsatt 1000 ml EtOAc, og MeOH ble fjernet ved avdamping. Tilsetting av 1000 ml Et₂O forårsaket en presipitasjon. Omrøring fortsatte ved romtemperatur i 2 timer før etterlatning av slurryen i fryser over natten (-18 °C). Filtrering og vasking to ganger med 200 ml Et₂O ga 172 g brunlig fast stoff etter tørking i vakuum ved 40 °C. Det brunlige faste stoffet ble behandlet med 1500 ml kokende H₂O i 1 time før avkjøling til romtemperatur i ytterligere 2 timer. Filtrering og tørking i vakuum ved 40 °C over natten ga 98 g 4-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin-hydrobromid (61 %).

Eksempel 21

102 g 2-brom-jodbenzen (362 mmol) og 50 g 2,4-dimetyltiofenol (362 mmol) løses i 1000 ml toluen. Til denne løsningen ble 81 g BOC-piperazin (434 mmol) etterfulgt av 2,08 g Pddba₂ (1 mol%) og 4,51 g rac-BINAP (2 mol%) tilsatt. Blandingen ble renset med nitrogen i 5 minutter før tilsetting av en slurry med 87 g NaOBu^t (905 mmol) i 300 ml toluen. Suspensjonen ble varmet til 100 °C under nitrogen over natten. En GCMS-analyse viste full omdannelse til intermediatproduktet (1-(2-bromfenylsulfanyl)-2,4-dimetyl-benzen) og temperaturen ble økt til refluks (120 °C) i ytterligere 24 timer. En HPLC-analyse viste full omdannelse til intermediatet (1-BOC-4-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin). Reaksjonsblandingen ble avkjølt på is i en time før filtrering av blandingen. Filterkaken vaskes med 2 x 200 ml toluen og til de kombinerte filtratene ble 80 ml 48 vektprosent HBr (aq.) tilsatt etterfulgt av oppvarming til refluks i 18 timer hvoretter full avbeskyttelse ble påvist ved HPLC. Blandingen ble avkjølt på is i 2 timer og filtrert. Det brunlige faste stoffet ble løst i 1000 ml kokende H₂O i 1 time sammen med aktivertt tjærekull (25 g), filtrert mens varm og hensatt for å avkjøles. Presipitatet ble samlet ved filtrering og tørking i vakuum ved 40 °C over natten ga 49 g 4-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin-hydrobromid (36 %) som et hvitt, fast stoff.

Eksempel 22

500 ml toluen ble plassert i en 1 l trehalset rundkolbe med en mekanisk rører og tilsatt 809 mg Pd₂dba₃ (0,88 mmol; 0,5 mol-%) og 952 mg DPEPhos (1,77 mmol; 0,5 mol-%). Den mørkerøde løsningen ble renset med nitrogen i 5 minutter før tilsetting av 100 g 2-bromjodbenzen (353 mmol) og 48,9 g 2,4-dimetyltiofenol (353 mmol) fant sted. Tilsetting av 43,6 g KOBu^t (389 mmol) forårsaket en eksotermreaksjon som økte temperaturen fra 20 °C til 42 °C samtidig med dannelsen av en heterogen blanding, og fargen skiftet fra mørkerød til oransje/brunlig. Suspensjonen ble oppvarmet til 100 °C under nitrogen. Etter bare 20 minutter viste en HPLC full omdannelse til 1-(2-bromfenylsulfanyl)-2,4-dimetyl-benzen. Blandingen ble avkjølt til 40 °C, tilsatt 600 ml 15 vektprosent NaCl og omrørt i 5 minutter. Den organiske fasen ble separert og den vandige fasen ble vasket med 2 x 100 ml toluen. De kombinerte organiske fasene ble vasket med 100 ml 2 M HCl (aq.), 100 ml 15 vektprosent NaCl, tørket over Na₂SO₄, refluksert i 15 minutter med aktivert tjærekull (10 g), filtrert to ganger og inndampet til 107,3 g oransje-rød olje (103 %) som ble funnet å være 98 % ren ved HPLC.

En løsning med 90 gram av den oransje-røde oljen (307 mmol) i 500 ml tørt toluen ble tilsatt 57 gram boc-piperazin (307 mmol), avgasset med nitrogen i 5 minutter, tilsatt 1,4 g Pd₂dba₃ (1,53 mmol; 0,5 mol%) og 2,9 g rac-BINAP (4,6 mmol; 1,5 mol%), avgasset i nye 2 minutter før tilsetting av 35,4 gram Bu^tONa (368 mmol) og varmet til 80 °C i 18 timer. HPLC viste full omdannelse og reaksjonsblandingen ble avkjølt til RT, filtrert og filterkaken ble vasket med 2 x 100 ml toluen. De kombinerte filtratene ble ekstrahert to ganger med 2 x 150 ml 15 vektprosent NaCl, tørket over Na₂SO₄, tilsatt tjærekull, refluksert i 30 minutter, filtrert to ganger og inndampet til 140,7 gram brunlig olje (4-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-BOC-piperazin). Den ubearbeidede oljen ble løst i 300 ml MeOH og 200 ml 6 M HCl (aq.) og refluksert i 1 time hvoretter HPLC viste full avbeskyttelse. Etter avkjøling til RT ble metanole fjernet under vakuum på en rotasjonsinndamper, 200 ml kons. NaOH (pH ble målt til 13-14) ble tilsatt hvoretter blandingen ble omrørt 15 minutter med 1000 ml EtOAc. Den organiske fasen ble samlet og ekstrahert med 300 ml 15 vektprosent saltløsning, tørket over Na₂SO₄ og satt til en løsning av 46,3 g fumarsyre (399 mmol) i 300 ml MeOH. Blandingen ble varmet til refluks, avkjølt til romtemperatur og deretter hensatt i fryser over natten (-18 °C). Presipitatet ble samlet, vasket med 100 ml EtOAc og 100 ml aceton, tørket i vakuum (50 °C) for å gi 103,2 g 1-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin-fumarat (249 mmol) som et hvitt pulver i 81 % totalt utbytte med en renhet på 99 % ved LC-MS. Fumaratet ble overført til den fri basen (1-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin) ved anvendelse av EtOAc/H₂O/kons. NaOH, den organiske fasen ble vasket med saltløsning, tørket ved bruk av Na₂SO₄, filtrert, og til filtratet ble 34 ml 48 vektprosent HBr (aq.) tilsatt, noe som forårsaket presipitasjon av et hvitt, fast stoff. Det faste stoffet ble samlet, behandlet med 1000 ml kokende H₂O, som ved avkjøling til romtemperatur dannet en slurry. Sluttproduktet (1-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin-hydrobromid) ble samlet ved filtrering og tørket i vakuum (50 °C) for å gi 83 g hvitt pulver (71 % utbytte totalt), CHN (teoretisk) 56,99; 6,11; 7,39; CHN (funnet) 57,11; 6,15; 7,35.

Eksempel 23

815 g NaOBu^t (8,48 mol), 844 g Piperazin (9,8 mol), 6,6 g Pd(dba)₂ (11,48 mmol) og 13,6 g rac-BINAP (21,84 mmol) ble omrørt med 4 l toluen i 50 minutter. 840 g 2-brom-jodbenzen (2,97 mol) ble deretter tilsatt sammen med 1,5 l toluen og omrøring fortsatte i 30 min. 390,8 g 2,4-dimetyltiofenol (2,83 mol) ble til slutt tilsatt med 1,5 l toluen. Suspensjonen ble varmet til refluks og refluks fortsatte i 5 timer.

Reaksjonsblandingen ble kjølt ned over natten. 2 l vann ble tilsatt og omrørt i 1 time før blandingen ble filtrert gjennom filtreringsfremmende middel. Filtratet ble deretter vasket med 3x 1 l saltløsning. De kombinerte vannfasene ble deretter ekstrahert med 600 ml toluen. De kombinerte toluenfasene ble deretter varmet til 70 °C etterfulgt av tilsetting av 329,2 ml 48 vektprosent HBr (aq.) og 164,6 ml vann. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur over natten. Sluttproduktet (1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin-hydrobromid) ble samlet ved filtrering og tørket i vakuum (60 °C) for å gi 895 g (84 % utbytte).

Eksempel 24

40,76 g NaOBu^t (424,1 mol), 0,33 g Pddba₂ (0,57 mmol) og 0,68 g rac-BINAP (1,09 mmol) ble omrørt med 200 ml toluen.42 g 2-brom-jodbenzen (362 mmol) og 19,54 g 2,4-dimetyltiofenol (362 mmol) ble tilsatt 50 ml toluen. Suspensjonen ble varmet til refluks og refluks fortsatte over natten. En HPLC-analyse viste full omdannelse til intermediatproduktet (1-(2-brom-fenylsulfanyl)-2,4-dimetyl-benzen).

Reaksjonsblandingen ble avkjølt til RT og filtrert gjennom filtreringsfremmende middel. Filtratet ble satt til en blanding av 40,76 g NaOBu^t (424,1 mmol), 42,2 g piperazin (489,9 mmol), 0,33 g Pddba₂ (0,57 mmol) og 0,68 g rac-BINAP (1,09 mmol) og varmet til refluks i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble kjølt ned over natten.

100 ml vann ble tilsatt og den vannfasen separert fra. Den organiske fasen ble filtrert gjennom filtreringsfremmende middel og filtratet ble deretter vasket med 3x 80 ml saltløsning. De kombinerte vannfasene ble deretter ekstrahert med 50 ml toluen. De kombinerte toluenfasene ble deretter varmet til 70 °C og etterfulgt av tilsetting av 16,5 ml 48 vektprosent HBr (aq.) og 8,25 ml vann. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur over natten. Sluttproduktet (1-[2-(2,4-dimetyl-fenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin-hydrobromid) ble samlet ved filtrering og tørket i vakuum (60 °C) for å gi 40,18 g offwhite pulver (75 % utbytte).

Eksempel 25

40,76 g NaOBu^t (424,1 mmol), 0,33 g Pddba₂ (0,57 mmol) og 0,68 g rac-BINAP (1,09 mmol) ble omrørt med 200 ml toluen.42 g 2-brom-jodbenzen (148,5 mmol) og 19,54 g 2,4-dimetyltiofenol (141,4 mmol) ble tilsatt 50 ml toluen. Suspensjonen ble varmet til refluks, og refluks fortsatte over natten. En HPLC-analyse viste full omdannelse til intermediatproduktet (1-(2-brom-fenylsulfanyl)-2,4-dimetyl-benzen). Reaksjon avkjølt til 50 °C og 42,2 g piperazin (489,9 mmol) ble tilsatt sammen med 100 ml toluen. Blandingen ble varmet til refluks i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til RT over natten. 100 ml vann ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom filtreringsfremmende middel. Filterkaken ble deretter vasket med 50 ml toluen.

Vannfasen ble separert fra og den organiske fasen ble deretter vasket med 3x 25 ml saltløsning og 25 ml vann. De kombinerte vannfasene ble deretter ekstrahert med 30 ml toluen. De kombinerte toluenfasene ble deretter varmet til 70 °C og etterfulgt av tilsetting av 16,46 ml 48 vekt-% HBr (aq.) og 8,23 ml vann. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur over natten. Sluttproduktet (1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)-fenyl]-piperazin-hydrobromid) ble samlet ved filtrering og tørket i vakuum (60 °C) for å gi 46,8 g (87 % utbytte).

Eksempel 26 Effekter på ekstracellulære nivåer av acetylkolin i hjernen hos frittgående rotter

MetoderDyrene ble administrert 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)fenyl]piparazin, HBrsalt.

Dyr

Det ble brukt hann Sprague-Dawley-rotter som i utgangspunktet veide 275-300 g. Dyrene ble huset under en 12 t lys/mørkesyklus under kontrollerte betingelser for vanlig innendørstemperatur (21±2°C) og fuktighet på (55±5 %) med fôr og springvann tilgjengelig etter behov.

Kirurgi og mikrodialyseeksperimenter

Rotter ble bedøvet med hypnorm/dormicum (2 ml/kg) og intracerebrale ledekanyler (CMA/12) ble stereotaktisk implantert i hjernen med hensikt å plassere dialyseprobespissen i den ventrale hippocamus (koordinater: 5,6 mm posterior for bregma, lateral –5,0 mm, 7,0 mm ventralt for dura) eller i den prefrontale korteks (koordinater: 3,2 mm anterior for bregma; lateral, 0,8 mm; 4,0 mm ventralt for dura). Forankringsskruer og akrylsement ble anvendt for å feste ledekanylene. Dyrenes kroppstemperatur ble overvåket med rektal probe og holdt på 37 °C. Rottene fikk restituere etter kirurgien i 2 dager og huset hver for seg i bur. Den dagen eksperimentet ble utført, ble en mikrodialyseprobe (CMA/12, 0,5 mm diameter, 3 mm lang) innført gjennom ledekanylen.

Probene ble koblet til en mikroinjeksjonspumpe via en dobbelt kanalsvivel. Perfusjon av mikrodialyseproben med filtrert Ringers løsning (145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1,2 mM CaCl₂ inneholdende 0,5 µM neostigmin) ble påbegynt kort før proben ble innført i hjernen og fortsatte gjennom hele eksperimentet med en konstant strømningshastighet på 1 µl/min. Etter 180 min stabilisering, startet eksperimentene. Dialysater ble samlet hvert 20 min. Etter eksperimentene ble dyrene avlivet ved halshugging og hjernene uttatt, frosset og snittet opp for å verifisere probeplassering.

Forbindelsen løst i 10 % HPbetaCD og injisert subkutant (2,5 – 10 mg/kg). Dosene uttrykkes som mg salt/kg kroppsvekt. Forbindelsen ble administrert i et volum på 2,5 ml/kg.

Analyser av acetylkolin i dialysat

Konsentrasjon av acetylkolin (ACh) i dialysatene ble analysert ved anvendelse av HPLC med elektrokjemisk påvisning ved anvendelse av en mobil fase bestående av 100 mM dinatriumhydrogenfosfat, 2,0 mM oktansulfonsyre, 0,5 mM tetrametylammoniumklorid og 0,005 % MB (ESA), pH 8,0. En forkolonneenzymreaktor (ESA) inneholdende immobilisert kolinoksidase eliminerte kolin fra den injiserte prøven (10 µl) før separationen av ACh på den analytiske kolonnen (ESA ACH-250); strømningshastighet 0,35 ml/min, temperatur: 35 °C. Etter den analytiske kolonnen passerte prøven gjennom en postkolonne-fastfasereaktor (ESA) inneholdende immobilisert acetylkolinesterase og kolinoksidase. Den sistnevnte reaktoren omdannet ACh til kolin og deretter kolin til betain og H₂O₂. Sistnevnte ble påvist elektrokjemisk ved bruk av en platinaelektrode (Analytisk celle: ESA, modell 5040).

Datapresentasjon

I enkeltinjeksjonseksperimenter tjente middelverdien av 3 etterfølgende ACh-prøver umiddelbart før administrasjon av forbindelse som basisnivået for hvert eksperiment og data ble konvertert til prosentdel av basisnivå (midlere preinjeksjonsbasisverdier normalisert til 100 %).

Resultater

Forbindelsen økte signifikant ekstracellulære nivåer av ACh i den prefrontale korteks og den ventrale hippocampus hos rotter – se figur 19a og 19b.

Eksempel 27 Kontekstuell betinging av frykt hos rotter

Forbindelsen administerert i det foreliggende eksperimentet var 1-[2-(2,4-dimetylfenylsulfanyl)fenyl]piperazin-HBr-salt.

Vi har studert effekten av forbindelsen på ervervelse av, konsolidering av og minne om kontekstuell betinging av frykt hos rotter. I paradigmet med betinging av frykt lærer dyr å assosiere nøytrale omgivelser (kontekst, treningsrommet, CS) med en aversiv erfaring (et elektrisk fotsjokk, US). Under reeksponering for treningsrommet viser dyr en fryktlammende atferd som oppfattes som et direkte mål på det fryktrelaterte minnet [Pavlov J. Biol. Sci, 15, 177-182, 1980]. Nevroanatomien ved kontekstuell betinging av frykt er nøye undersøkt og flere studier har vist at hippocampus og amygdala er nødvendige for dannelsen av dette minnet [Hippocampus, 11, 8-17, 2001; J. Neurosci, 19, 1106-1114, 1999; Behav. Neurosci, 106, 274-285, 1992].

Dyr og legemidler

Voksne Sprague–Dawley hannrotter (som veide 250-300 g da de ble trenet) fra Charles River Laboratories, huset to per bur med en 12 timers lys/mørkesyklus, ble anvendt. Mat og vann var tilgjengelig ad libitum. Rottene ble anvendt 1 uke etter ankomst. Forbindelsen ble løst i 10 % HPbetaCD og injisert subkutant. Legemidlet ble administrert i et volum på 2,5 ml/kg.

Apparat

Trening og undersøkelse ble utført i et lydtett rom (30 x 20 x 40 cm) huset i et isolert rom og forbundet med et ventilasjonssystem. Belysning ble tilveiebragt av et hvitt lys (60 watt). Gulvet i rommet besto av et metallgitter koblet til en elektrisk sjokkgenerator. Før trening og undersøkelse ble rommet renset med en 70 % etanolløsning. Et videokamera tillot atferdsobservasjoner og opptak av treningssesjonene for offline-analyse.

Ervervelses- og retensjonstest

Under ervervelsen fikk dyrene fritt utforske de nye omgivelsene i en 1-minutts tilvenningsperiode som ble avsluttet med ett uunngåelig fotsjokk (ubetinget stimulus, US) gjennom det elektrisk ledende gittergulvet. Fotsjokket hadde en varighet på 2 sekunder og en intensitet på 0,75 mA. Dyrene ble i betingingsrommet i enda 60 sekunder etter US. Fryktlammet atferd ble bedømt i løpet av de første 58 sekundene (presjokk ervervelse; utprøver blindet for gruppene) for å bestemme grunnlinjefryktlammelsesresponser overfor konteksten. På slutten av ervervelsen ble dyrene varsomt fjernet og plassert i sine hjemmebur. Etter 24 timer ble de samme dyrene ført tilbake til treningskonteksten (fryktbetingingsrommet) og en 2 minutters retensjonstest ble utført. I løpet av denne perioden ble det ikke gitt noen fotsjokk.

Fryktlammet atferd ble bedømt under hele testperioden av utprøveren som var blindet for gruppene og presentert som prosent av total testperiode.

Resultater og diskusjon

Effekt av forbindelsen på kontekstuell fryktkognisjon hos rotter

Effekten av forbindelsen på kontekstuell betinging av frykt hos rotter ble studert (i) ved ervervelse (legemidlet gitt før ervervelse, figur 20), (ii) ved gjenkallelse av minne (legemidlet gitt før testen, figur 21) og (iii) ved konsolidering (legemidlet gitt umiddelbart etter ervervelse, figur 22). I det første settet av eksperimenter ble forbindelsen (1, 5 og 10 mg/kg) administrert 1 time før ervervelsessesjonen. Figur 20 beskriver ervervelsen av fryktlammet atferd under trening (58 sekunder før fotsjokket) og retensjonstesten 24 etter. Følgende funn ble observert:

- Forbindelsen påvirker ikke grunnlinje fryktlammet atferd før innføringen av fotsjokk ved enhver testet dose.

- Forbindelsen ved 5 mg/kg har en tendens til å øke tid medgått til fryktlammelse under retensjonstesten, 24 timer etter ervervelsen (39,24 ± 13,76 %, n= 6, versus 24,30 ± 4,40 %, n= 16, i vehikkelbehandlede dyr).

- Forbindelsen ved 10 mg/kg økte tid medgått til fryktlammelse under retensjonstesten signifikant, 24 timer etter ervervelsen (52,15 ± 5,68 %, n= 10, versus 24,30 ± 4,40 %, n= 16, i vehikkelbehandlede dyr, p< 0,01).

Fryktbetingingsmodellen som beskrevet i figur 20, er en standard prosedyre beskrevet i litteraturen for å undersøke læring og hukommelse. For ytterligere å klargjøre de umiddelbare effektene dette legemidlet har på gjenkallelse av minne, ble forbindelsen (5, 10 og 20 mg/kg) gitt 1 time før retensjonstesten. Det ble observert at forbindelsen inhiberer uttrykket av fryktlammet atferd ved 5 mg/kg under hukommelsestesten (12,86 ± 3,57 %, n= 9, versus 33,61 ± 4,29 %, n= 13, hos vehikkelbehandlede dyr, p< 0,05) (figur 21).

Som beskrevet ovenfor påvirker ikke forbindelsen i seg selv grunnlinje fryktlammet atferd før inntreden av US (figur 20), således er den mest plausible hypotesen at den observerte effekten i figur 21 skyldes en angstdempende effekt. Det betingede minnet evalueres ved fryktlammet atferd, en respons som svekkes av forbindelser med potensielt angstdempende virkning. Dette eksperimentet viser at når forbindelsen gis umiddelbart før gjenkallelse av minne har den angstdempende effekt, det er derfor usannsynlig at økt fryktlammelse vist i figur 20 skyldes en angstdempende effekt av forbindelsen.

For å styrke den antagelse at forbindelsen ikke er angstdempende, men har prokognitivt potensial, ble forbindelsen administrert ved 5, 10 og 20 mg/kg etter ervervelsessesjonen. I dette settet av eksperimenter var forbindelsen følgelig ikke ombord verken under ervervelsen eller gjennom retensjonstesten. Her ble det observert at forbindelsen ved 5 mg/kg signifikant øker tid medgått til fryktlammelse under retensjonstesten, 24 timer etter ervervelsessesjonen (45,58 ± 4,50 %, n= 8, versus 25,26 ± 3,57 %, n= 19, hos vehikkelbehandlede dyr, p< 0,05). Prosentdelen av tiden medgått til fryktlammelse under reeksponering for kontekst har blitt beskrevet som et mål på fryktrelatert hukommelse [Pavlov J. Biol. Sci, 15, 177-182, 1980], som økes hos rotter som er behandlet med forbindelsen sammenlignet med vehikkelbehandlede dyr (figur 20 og 21). Sett under ett viser dataene at forbindelsen øker kontekstuell hukommelse.