Foreliggende oppfinnelse vedrører 4-((i/?,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin, spesielt hydrogensuccinat- og hydrogenmalonatsaltene derav, fremgangsmåter for fremstillingen av 4-((i/?,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-tirmetylpiperazin og saltene derav, farmasøytiske sammensetninger inneholdende disse salter og den medisinske anvendelse derav, inklusive behandling av schizofreni eller andre sykdommer som involverer psykotiske symptomer.

Forbindelsen som er gjenstanden av den foreliggende oppfinnelse, [4-((ii?,3S)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin], har den generelle formel (I):

EP 638 073 dekker en gruppe av trans- isomer er av 3-aryl-l-(l-piperazinyl)indaner substituerte i 2- og/eller 3-stillingen på piperazinringen. Forbindelsene er beskrevet å ha høy affinitet for dopamin Di og D₂-reseptorer og 5-HT₂-reseptoren og er foreslått å være nyttige forbehandling av flere sykdommer i sentralnervesystemet, inklusive schizofreni. EP 638 073 beskriver ikke den spesifikke enantiomere form av forbindelsen over med formel (I), bare _/røws-isomerer i form av racemater er beskrevet.

Enantiomeren med formel (I) over har blitt beskrevet av Bøgesø et al. i J. Med. Chem., 1995, 38, side 4380-4392, i form av fumaratsaltet, se tabell 5, forbindelse (-)-38. Denne publikasjon konkluderer med at (-)-enantiomerene av forbindelse 38 er potente D₁/D₂-antagonister som viser noe Di-selektivitet in vitro mens den in vivo er ekvipotent som Di-og D₂-antagonist. Forbindelsen er også beskrevet som en potent 5-HT₂-antagonist og som å ha høy affinitet for ai-adrenoreseptorer. Det er også nevnt at forbindelsen ikke induserer katalepsi i rotter.

Det tilsvarende racemat samt fumaratsaltet av forbindelsen over med formel (I) er også beskrevet av Klaus P. Bøgesø i "Drug Hunting, the Medicinal Chemistry of l-Piperazino-3-phenylindans and Related Compounds", 1998, ISBN 87- 88085- 10- 4 0'fr. f eks. forbindelse 69 i tabell 3, s. 47 og i tabell 9A, s. 101).

Således er forbindelsen med formel (I) en blandet D_iÆ>₂-antagonist, en 5-HT₂-antagonist og den har også affinitet forai-adrenoreseptorer. I det følgende skisseres den mulige forbindelse mellom forskjellige sykdommer og henholdsvis dopamin Di- og D₂-reseptorene, 5-HT₂-reseptorene og ai-adrenoreseptorene.

Schizofrenis etiologi er ikke kjent, men dopaminhypotesen for schizofreni (Carlsson, Am. J. Psychiatry 1978, 135, 164-173), formulert på begynnelsen av 1960-tallet, har gitt et teoretisk grunnlag for forståelse av de biologiske mekanismer som ligger under denne lidelse. I sin enkleste form fastsetter dopaminhypotesen at schizofreni er assosiert med en hyperdopaminergisk tilstand, en oppfatning som er støttet av det faktum at alle antipsykotiske legemidler på markedet i dag utøver noe dopamin D₂-reseptorantagonisme (Seeman Science and Medicine 1995, 2, 28-37). Mens det generelt er akseptert at antagonisme av dopamin D₂-reseptorer i de limbiske områder i hjernen spiller en nøkkelrolle i behandlingen av positive symptomer av schizofreni, forårsaker imidlertid blokaden av D₂-reseptorer i striatale områder i hjernen ekstrapyramidale symptomer (EPS). Som beskrevet i EP 638 073 har en profil av blandet dopamin D_i/D₂-reseptorhemming blitt observert med noen såkalte "atypiske" antipsykotiske forbindelser, spesielt med klozapin, anvendt i behandling av schizofrene pasienter.

Sentrale ai-antagonistiske virkninger har også blitt foreslått å bidra i forbedring av antipsykotiske egenskaper (Millan et al, JPET, 2000, 292, 38-53).

Videre har selektive Di-antagonister blitt forbundet med behandling av søvnforstyrrelser og alkoholmisbruk (D.N.Eder, Current Opinion in Investigational Drugs, 2002 3(2):284-288). Dopamin kan også spille en viktig rolle i etiologien av affektive lidelser (P. Willner, Brain. Res. Rev. 1983, 6, 211-224, 225-236 og 237-246; J. Med. Chem., 1985, 28, 1817-1828).

I EP 638 073 beskrives hvordan forbindelser som har affinitet for 5-HT₂-reseptorer, spesielt 5-HT₂-reseptorantagonister, har blitt foreslått for behandling av forskjellige sykdommer, slik som schizofreni inklusive de negative symptomer i schizofrene pasienter, depresjon, angst, søvnforstyrrelse, migreneanfall og nevroleptikumindusert parkinsonisme. 5-HT₂-reseptorantagonisme har også blitt foreslått å redusere forekomsten av ekstrapyramidale bivirkninger indusert av klassiske nevroleptika (Balsara et al. Psychopharmacology 1979, 62, 67-69).

Figur 1: viser et pulverrøntgendiffraktogram av den krystallinske form alfa av hydrogensuccinatsaltet av forbindelse I (oppnådd ved å anvende kobber Kai-stråling (_X=1,_5406Å)) Figur 2: viser et pulverrøntgendiffraktogram av den krystallinske form beta av hydrogensuccinatsaltet av forbindelse I (oppnådd ved å anvende kobber Kai-stråling (_X=1,₅₄₀₆Å)) Figur 3: viser et pulverrøntgendiffraktogram av hydrogenmalonatsaltet av forbindelse I

Det har nå blitt funnet at den vandig løselighet av hydrogensuccinatsaltet og hydrogenmalonatsaltet av forbindelsen med formel (I) er betydelig større enn den vandige løselighet av det tilsvarende fumaratsalt.

Som anvendt heri refererer begrepet "hydrogensuccinat"-salt av forbindelsen med formel (I) til 1:1 saltet av forbindelsen med formel (I) og ravsyre.

Som anvendt heri refererer begrepet "hydrogenmalonat"-salt av forbindelsen med formel (I) til 1:1 saltet av forbindelsen med formel (I) og malonsyre.

Hydrogensuccinatsaltet ble funnet å være mer stabilt enn fumaratsaltet og enn hydrogenmalonatsaltet og å være ikke-hygroskopisk.

Hydrogenmalonatsaltet av forbindelse I ble funnet å ha en stabilitet lignende fumaratsaltet når eksponert for lys og mer stabilt når eksponert for 60 °C/80 % relativ fuktighet (RH), men mindre stabilt enn fumaratsaltet ved 90 °C. 90 °C er imidlertid en svært stresset betingelse, og gjelder ikke nødvendigvis stabilitet ved normale betingelser. Malonatet absorberer gradvis opptil 1 % vann når den relative fuktighet heves til 95 %, men uten hysterese. Det er derfor ansett som ikke-hygroskopisk, men med gode fuktingsegenskaper, som indikerer fordelaktige oppløsningsegenskaper.

Oppfinnelsen dekker også krystallinske salter av oppfinnelsen, inklusive, f. eks. anhydrater hydrater og solvater av saltene av oppfinnelsen. Med begrepet anhydrat menes saltene av oppfinnelsen som ikke inneholder krystallbundet vann. Med hydrater menes saltene av oppfinnelsen som inneholder krystallbundne vannmolekyler. Hydrater fremstilles vanligvis ved dannelse av saltet i nærvær av noe vann. Med solvater menes saltene av oppfinnelsen inneholdende krystallbudne løsningsmiddelmolekyler. Solvater fremstilles vanligvis ved dannelse av succinatsaltet i nærvær av løsningsmidlet. Løsningsmiddelmolekylene i et enkelt solvat kan være fra ett eller to eller flere forskjellige løsningsmidler. Et solvat kan omfatte vann som ett av to eller flere organiske løsningsmidler eller være bare et ikke-vann løsningsmiddel.

Én utførelsesform av oppfinnelsen vedrører 1:1 saltet av trans- 4-(( lR, 3S)- 6- klor- 3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin, dvs. av forbindelsen med formel (I), og ravsyre i form av et krystallinsk anhydrat.

Oppfinnerne har oppdaget 2 krystallinske former av hydrogensuccinatsaltet av forbindelse I (betegnet alfa og beta).

Således vedrører én utførelsesform en krystallinsk form av hydrogensuccinatsaltet av forbindelse I, hvis form betegnes alfa og er karakterisert ved én eller flere av: (i) et pulverrøntgendiffraktogram som vist i figur 1; (ii) et pulverrøntgendiffraktogrammønster som illustrert i tabell I oppnådd ved å anvende kobber Kai-stråling (X=l ,5406 Å) som viser hovedtopper ved de gitte 28-vinkler; (iii) som har en DSC (differensial skanningkalorimetri) -kurve som viser en endoterm med

En ytterligere utførelsesform vedrører en krystallinsk form av hydrogensuccinatsaltet av forbindelse I, hvilken form betegnes beta og er karakterisert ved én eller flere av: (i) et pulverrøntgendiffraktogram som vist i figur 2; (ii) et pulverrøntgendiffraktogrammønster som illustrert i tabell I oppnådd ved å anvende kobber Kai stråling (X=l,5406 Å) som viser hovedtopper ved de gitte 28-vinkler;

En ytterligere utførelsesform vedrører et krystallinsk hydrogenmalonatsalt av forbindelse I karakterisert ved én eller flere av: (i) et pulverrøntgendiffraktogram som vist i figur 3; (ii) et pulverrøntgendiffraktograrnmønster som illustrert i tabell I oppnådd ved å anvende

kobber Kai-stråling (X=l ,5406 Å) som viser hovedtopper ved de gitte 28-vinkler.

Tabell 1. Karakteristiske pulverrøntgendiffraktogramer oppnådd ved å anvende kobber Kai-stråling ( k=1,5406 Å) av krystallformene alfa og beta av hydrogensuccinatsaltet av forbindelse I, og det krystallinsk hydrogenmalonatsalt av forbindelse I. Fig; cf. også fig. 1, fig. 2 og fig. 3 som gir et representativt XRPD-mønster av polymorf form alfa og beta av henholdsvis hydrogensuccinatsaltet og malonatsaltet av forbindelse I.

Som anvendt heri ved uttrykk som "krystallinsk form av et spesifikt salt av forbindelse I karakterisert ved pulverrøntgendiffraktogramet vist i figur (1)" menes den krystallinske form av et salt av den aktuelle forbindelse I som har et pulverrøntgendiffraktogram hovedsakelig lignende figur (1), dvs. som foreviser et pulverrøntgendiffraksjonsmønster hovedsakelig som eksemplifisert i denne figur og målt under sammenlignbare betingelser som beskrevet heri eller ved enhver lignende metode.

Generelt er alle data heri forstått å være approksimative og underkastet normale målefeil avhengig av/ eks. det anvendte apparat og andre parameterer som har innflytelse på topp-posisjoner og toppintensiteter.

Oppfinnelsen vedrører også et fast hydrogensuccinatsalt av forbindelse I hvilket faste salt hovedsakelig består av alfa-formen sammenlignet med den totale mengde av saltet. I én utførelsesform betyr begrepet "hovedsakelig" at det faste hydrogensuccinatsalt av forbindelse I består av minst 75 %, slik som minst 80 %, minst 90 %, eller minst 95 % krystallinsk alfa-form sammenlignet med det total hydrogensuccinatsalt av forbindelse I til stede.

Oppfinnelsen vedrører også et fast hydrogensuccinatsalt av forbindelse I hvilket faste salt hovedsakelig består av beta-formen sammenlignet med den totale mengde av saltet. I én utførelsesform betyr begrepet "hovedsakelig" at det faste hydrogensuccinatsalt av forbindelse I består av minst 75 %, slik som minst 80 %, minst 90 %, eller minst 95 % krystallinsk beta-form sammenlignet med det totale hydrogensuccinatsalt av forbindelse I til stede.

Oppfinnelsen vedrører også alle blandinger av de krystallinske former av hydrogensuccinatsaltet av oppfinnelsen,/ eks. en blanding av den alfa- og beta-krystallinske form av hydrogensuccinatsaltet av forbindelse I.

Succinatsaltet i henhold til oppfinnelsen kan oppnås ved behandling av den frie base av en forbindelse med formel (I) med ravsyre i et inert løsningsmiddel etterfulgt av presipitasjon, isolasjon og eventuelt omkrystallisasjon. Hvis ønsket, kan det krystallinske salt deretter underkastes mikronisering ved fuktig eller tørr maling eller en annen beleilig prosess, eller fremstilling av partikler fra en løsningsmiddel-emulgeringsprosess.

Presipitasjon av succinatsaltet av oppfinnelsen utføres fortrinnsvis ved å løse den frie base av forbindelsen med formel (I) i et passende løsningsmiddel, slik som aceton eller toluen, og deretter blanding av denne løsning til en suspensjon eller løsning av ravsyre i et passende løsningsmiddel, slik som aceton, vandig aceton eller toluen. I én utførelsesform er løsningsmidlet en blanding av aceton og vann, f. eks. en blanding hovedsakelig bestående av aceton og ca 2 % til 10 %, fortrinnsvis ca 5 % vann, basert på vekten av blandingen. Den resulterende suspensjon kan varmes eller løsningsmiddel kan tilsettes inntil all ravsyre har løst seg. Succinatsaltet av forbindelsen av oppfinnelsen presipiteres, fortrinnsvis ved avkjøling av løsningen. Succinatsaltet av oppfinnelsen kan eventuelt omkrystalliseres én eller flere ganger og isoleres ved filtrering, vaskes,/ eks. med aceton, og tørkes.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstillingen av den krystallinske beta-form av hydrogensuccinatsaltet av forbindelse I, hvilken fremgangsmåte omfatter å etterlate en vandig løsning av hydrogensuccinatsalt av forbindelse I for langsom fordamping av løsningsmidlet ved omgivelsesbetingelser.

Malonatsaltet kan oppnås ved å anvende analoge prosedyrer. Følgelig kan malonatsaltet i henhold til oppfinnelsen oppnås ved behandling av den frie base av en forbindelse med formel (I) med malonsyre i et inert løsningsmiddel etterfulgt av presipitasjon, isolasjon og eventuelt omkrystallisasjon. Hvis ønsket kan det krystallinske salt deretter underkastes mikronisering ved fuktig eller tørr maling eller en annen beleilig prosess, eller fremstilling av partikler fra en løsningsmiddel-emulgeringsprosess.

Presipitasjon av malonatsalt av oppfinnelsen utføres fortrinnsvis ved å løse den frie base av forbindelsen med formel (I) i et passende løsningsmiddel,/ eks. 2-propanol, og deretter blanding av denne løsning til en suspensjon eller løsning av malonsyre i et passende løsningsmiddel,/ eks. 2-propanol. Suspensjonen kan varmes inntil all malonsyre har løst seg. Malonatsaltet av forbindelsen av oppfinnelsen presipiteres, fortrinnsvis ved avkjøling av løsningen. Malonatsaltet av oppfinnelsen kan eventuelt omkrystalliseres én eller flere ganger og isoleres ved filtrering, vaskes,/ eks. i 2-propanol, og tørkes.

Forbindelsen med formel (I) i racemisk form kan fremstilles som beskrevet i EP 638 073 og i Bøgesø et al. J. Med. Chem., 1995, 38, side 4380-4392, det er beskrevet hvordan optisk oppløsning av den racemiske forbindelse kan oppnås ved krystallisasjon av diastereomere salter for derved å oppnå enantiomeren med formel (I).

De nåværende oppfinnere har nå utviklet en forbedret synteserute hvor enantiomeren med formel (I) oppnås via en syntesesekvens startende fra enantiomert ren V, dvs. forbindelse Va ((iS,3S)-6-klor-3-fenylindan-l-ol, se under). I denne prosess oppløses således intermediatet med formel V,/ eks. ved kiral kromatografi eller enzymatisk, for å oppnå enantiomeren med formel Va. Denne nye synteserute for å oppnå forbindelsen med formel (I) er mye mer effektiv enn den ovennevnte krystallisasjon av diastereomere salter av sluttproduktet I. Spesielt er utbyttet av oppløsningen betydelig høyere i denne nye fremgangsmåte (45 % relativt til mengden av racemisk utgangsmateriale, dvs. maksimum teoretisk utbytte er 50 %) sammenlignet med utbyttet (22 % relativt til mengden av racemisk utgangsmateriale, dvs. maksimum teoretisk utbytte er 50 %) for oppløsningen av sluttproduktet I ved krystallisasjon av diastereomere salter. En annen fordel ved denne oppfinnelse er at den enantiomere renhet av (I) er høyere (høyere enn 99 %ee) når syntetisert i henhold til oppfinnelsen sammenlignet med syntesen som anvender krystallisasjon av diastereomere salter (95,4 %ee). Videre gir oppløsningen av et intermediat istedenfor sluttproduktet en mye mer effektiv syntese, fordi bare den riktige enantiomer anvendes i de etterfølgende trinn, som gir/ eks. høyere volumutbytter og mindre forbruk av reagenser.

Følgelig kan enantiomeren med formel (I) oppnås ved en fremgangsmåte som involverer de følgende trinn:

Benzylcyanid reageres med 2,5-diklorbenzonitril i nærvær av en base, passende kalium-tert-butoksid (t-BuOK) i et passende løsningsmiddel slik som dimetyleter (DME), videre reaksjon med metylkloracetat (MCA) fører til spontan ringlukking og "one pot" dannelse av forbindelsen med formel (II).

Forbindelsen med formel (II) underkastes deretter sur hydrolyse for å danne en forbindelse med formel (III), passende ved oppvarming i en blanding av eddiksyre, svovelsyre og vann, og deretter dekarboksylering ved oppvarming av forbindelsen med formel (III) i et passende løsningsmiddel, slik som toluen med trietylamin eller N-metylpyrrolidon, for å danne en forbindelse med formel (IV).

Forbindelsen med formel (IV) reduseres deretter, formålstjenlig med NaBH₄ i et løsningsmiddel slik som en alkohol,/ eks. etanol eller isopropanol, og fortrinnsvis ved en temperatur i området fra -30° til +30 °C,/ eks. under 30 °C, under 20 °C, under 10 °C, eller fortrinnsvis under 5 °C, for å danne en forbindelse med formel (V) med cis-konfigurasjon:

Forbindelsen med formel (V) oppløses for å oppnå den ønskede enantiomer (formel Va), dvs. også med cw-konfigurasjon ((75',35_,)-6-klor-3-fenylindan-l-ol):

Oppløsningen av (V) til (Va) kan,/ eks., utføres ved å anvende kiral kromatografi, fortrinnsvis væskekromatografi, formålstjenlig på en kiral kolonne av silikagel belagt med en kiral polymer,/ eks. en modifisert amylose, fortrinnsvis amylose tris-(3,5-dimetylfenylkarbamat) belagt på silikagel. Et passende løsningsmiddel anvendes for den kirale væskekromatografi, slik som,/ eks. en alkohol, et nitril, en eter eller et alkan, eller blandinger derav, formålstjenlig etanol, metanol, isopropanol, acetonitril eller metyl-tert-butyleter eller blandinger derav, fortrinnsvis metanol eller acetonitril. Den kirale væskekromatografi kan oppskaleres ved å anvende passende teknologier,/ eks. "simulated moving bead"-teknologi (SMB).

Alternativt oppløses forbindelsen med formel (V) for å oppnå forbindelse Va ved enzymatisk oppløsning. Det har blitt funnet at enantiomert ren forbindelse Va, eller acylerte derivater derav, kan fremstilles ved enzymatisk enantioselektiv acylering av hydroksyl-gruppen i racemisk forbindelse V for å oppnå forbindelse Va eller et acylert derivat derav med høy optisk renhet. Alternativt kan enantiomert ren forbindelse Va også oppnås ved en fremgangsmåte som omfatter å omdanne racemisk forbindelse V til en tilsvarende ester i hydroksylstillingen etterfulgt av en enzymatisk enantioselektiv deacylering. Anvendelse av enzymatisk enantioselektiv deacylering har blitt rapportert for andre forbindelser.

Følgelig kan oppløsningen av forbindelse V til forbindelse Va utføres ved selektiv enzymatisk acylering. Selektiv enzymatisk acylering betyr at den enzymatiske acylering fortrinnsvis er effektiv for omdannelse av én av c_/s-enantiomerene av forbindelsen med formel forbindelse V som etterlater den andre cw-enantiomer av forbindelse V som uomdannet i reaksjonsblandingen.

Alternativt kan oppløsningen av forbindelse V til forbindelse Va utføres ved selektiv enzymatisk deacylering. Selektiv enzymatisk deacylering betyr at den enzymatiske deacylering fortrinnsvis er effektiv for omdannelse av én av esterne av forbindelse med formel (V), som etterlater den andre cis-enantiomer av estere av en forbindelse med formel (V) som uomdannet i reaksjonsblandingen.Passende estere (Vb) av forbindelsen med formel (V) er estere slik som acetat, propionat, butyrat, valerat, heksanoat, benzoat, laurat, isobutyrat, 2-metylbutyrat, 3-metylbutyrat, pivalat, 2-metylvalerat, 3-metylvalerat, 4-metylvalerat

hvori R, f. eks., er acetat, propionat, butyrat, valerat, heksanoat, benzoat, laurat, isobutyrat, 2-metylbutyrat, 3-metylbutyrat, pivalat, 2-metylvalerat, 3-metylvalerat, 4-metylvalerat.

Således vedrører én utførelsesform en fremgangsmåte for fremstillingen av (S, S)- eller (R, R)-enantiomeren av forbindelsen med formel V (dvs. med c/s-konfigurasjon) omfattende: a) å underkaste en racemisk forbindelse V enantioselektiv enzymatisk acylering ved å anvende et acyleringsmiddel, eller b) å underkaste en racemisk forbindelse Vb enantioselektiv enzymatisk deacylering for å danne en blanding av deacylert forbindelse Va.

Enantioselektiv enzymatisk acylering betyr at den enzymatisk acylering fortrinnsvis er effektiv for omdannelse av én av enantiomerene av en forbindelse med formel (V) som fortrinnsvis etterlater den andre enantiomer av forbindelsen med formel (V) uomdannet i reaksjonsblandingen. Enantioselektiv enzymatisk deacylering betyr at den enzymatiske deacylering fortrinnsvis er effektiv for omdannelse av én av enantiomerene av en forbindelse med formel (Vb), som fortrinnsvis etterlater den andre enantiomer av forbindelsen med formel (Vb ) uomdannet i reaksjonsblandingen.

Blandingene oppnådd ved den enzymatiske oppløsning må ikke være fullstendig rene,/ eks. kan de inneholde en mindre mengde av den andre enantiomer i tillegg til en større mengde av den ønskede enantiomer (Va). Sammensetningsblandingen oppnådd etter acylering eller deacylering i henhold til oppfinnelsen avhenger, blant annet, av den spesifikke hydrolase anvendt og betingelsene under hvilke reaksjonen utføres. Kjennetegnende for den enzymatiske acylering/deacylering i henhold til oppfinnelsen er at en betydelig større del av én enantiomer omdannes enn av den andre. Den enantioselektive acylering i henhold til oppfinnelsen resulterer således i en blanding inneholdende fortrinnsvis forbindelsen med formel (Vb) i (R, R)-formen og forbindelsen med formel (Va) i (S, S)-formen, eller den kan resultere i en blanding inneholdende fortrinnsvis forbindelsen med formel (Vb) i (S, S)-formen og forbindelsen med formel (Va) i (R, R)-formen. Likeledes kan den enantioselektive enzymatisk deacylering resultere i en blanding inneholdende fortrinnsvis forbindelsen med formel (Vb) i (S, S)-formen og forbindelsen med formel (V) i (R, R)-formen, eller den kan resultere i en blanding inneholdende fortrinnsvis forbindelsen med formel (Va) i (R, R)-formen og forbindelsen med formel (Va) i (S, S)-formen. Den optiske renhet av Va oppnådd ved den optiske oppløsningsmetode av den foreliggende oppfinnelse er vanligvis minst 90 % ee, fortrinnsvis minst 95 % ee, mer foretrukket minst 97 % ee og mest foretrukket minst 98 % ee. Imidlertid er lavere verdier for den optiske renhet akseptable.

I henhold til oppfinnelsen utføres enantioselektiv enzymatisk acylering under betingelser som hovedsaklig undertrykker hydrolyse. Hydrolyse, som er den omvendte reaksjon av acyleringsreaksjonen, skjer hvis vann er til stede i reaksjonssystemet. Således utføres enantioselektiv enzymatisk acylering fortrinnsvis i et vannfritt organisk løsningsmiddel eller nesten vannfritt organisk løsningsmiddel (enzymer trenger normalt nærværet av noe vann for å være aktive). Passende løsningsmidler inkluderer hydrokarboner slik som heksan, heptan, benzen og toluen; etere slik som dietyleter, diisopropyleter, tetrahydrofuran, 1,4-dioksan, tert-butylmetyleter og dimetoksyetan; ketoner slik som aceton, dietylketon, butanon, og metyletylketon; estere slik som metylacetat, etylacetat, etylbutyrat, vinylbutyrat og etylbenzoat; halogenerte hydrokarboner slik som metylenklorid, kloroform og 1,1,1-trikloretan; sekundære og tertiære alkoholer, slik som tert-butanol; nitrogeninneholdende løsningsmidler slik som dimetylformamid, acetoamid, formamid, acetonitril og propionitril; og aprotiske polare løsningsmidler slik som dimetylsulfoksid, N-metylpyrrolidon og heksametylfosfortriamid. Foretrukne organiske løsningsmidler for enzymatisk acylering er organiske løsningsmidler slik som toluen, heksan, heptan, dioksan og tetrahydrofuran

(THF).

Passende irreversible acyldonorer er,/ eks., acyldonorer slik som vinylestere, 2-propenyl-estere eller 2,2,2-trihalid-etylestere.

Enantioselektiv enzymatisk deacylering utføres fortrinnsvis i vann eller en blanding av vann og et organisk løsningsmiddel, passende i nærvær av en buffer. Passende organiske løsningsmidler er,/ eks., løsningsmidler blandbare med vann slik som alkoholer, acetonitril, dimetylformamid (DMF), dimetylsulfoksid (DMSO), 1,4-dioksan, DME og diglyme.

Det har blitt funnet at enzymatisk acylering i henhold til oppfinnelsen kan utføres ved å anvende Novozym 435 (Candida Antarctica lipase B, fra Novozymes A/S, Fluka kat. nr. 73940). Generelt utføres den enzymatiske acylering eller deacylering i henhold til oppfinnelsen fortrinnsvis ved å anvende en lipase, en esterase, en acylase eller en protease. De nyttige enzymer i henhold til oppfinnelsen er slike enzymer i stand til å utføre R-selektiv acylering eller S-selektiv acylering av hydroksygruppen i den racemiske forbindelse med formel (V) eller slike enzymer som er i stand til å utføre R-selektiv deacylering eller S-selektiv deacylering av acylgruppen i den racemiske forbindelse med formel (Vb). Spesielt er immobiliserte former av enzymet, inklusive kryssbundet enzymkrystall (Cross-Linked Enzyme Crystal, CLEC) nyttige i henhold til oppfinnelsen. En foretrukket utførelsesform vedrører anvendelse av en lipase for å utføre den enzymatiske oppøsning av forbindelse V. Den mest foretrukne lipase er Candida antarctica lipase (Fluka kat. nr. 62299); Pseudomonas cepacia lipase (Fluka kat. nr. 62309); Novozym CALB L (Candida antarctica lipase B) (Novozymes A/S); Novozym 435 (Candida antarctica lipase B) (Novozymes A/S); eller Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus lipase) (Novozymes A/S), fortrinnsvis i immobilisert form.

Alkoholgruppen i c/s-alkoholen med formel (Va) omdannes til en passende utgående gruppe, slik som,/ eks., et halogen,/ eks. Cl eller Br, fortrinnsvis Cl, eller et sulfonat,/ eks. mesylat eller tosylat, formålstjenlig ved reaksjon med et middel, slik som tionylklorid, mesylklorid eller tosylklorid, i et inert løsningsmiddel,/ eks. en eter, formålstjenlig tetrahydrofuran. Den resulterende forbindelse har formel (VI), hvor LG er den utgående gruppe:

I en foretrukket utførelsesform er LG Cl, dvs. cis-kloridet med formel (Via):

Forbindelse VI,/ eks. med LG som klor, reageres deretter med 2,2-dimetylpiperazin i et passende løsningsmiddel,/ eks. et keton slik som,/ eks., metylisobutylketon eller metyletylketon, fortrinnsvis metylisobutylketon i nærvær av en base, slik som/ eks., kaliumkarbonat. Den resulterende forbindelse med formel (VII):metyleres ved den sekundære aminfunksjonalitet (formålstjenlig ved reduktiv aminering ved å anvende passende midler, slik som,/ eks., formaldehyd, paraformaldehyd, trioksan eller dietoksymetan (DEM)) for å oppnå den frie base av en forbindelse med formel (I).

Alternativt kan metylgruppen introduseres direkte ved bruk av 1,2,2-trimetylpiperazin (formel VIII under) istedenfor 2,2-dimetylpiperazin når reaksjon med forbindelse VI, f. eks. hvor LG er Cl, å derved forkorte syntesen med ett trinn.

Videre kan piperazindelen av molekylet introduseres ved å reagere forbindelse VI med en forbindelse med formel (IX) under, hvor PG er en beskyttelsesgruppe slik som, men ikke begrenset til,/ eks. fenylmetoksykarbonyl (ofte kalt Cbz eller Z), tert-butyloksykarbonyl (ofte kalt BOC), etoksykarbonyl eller benzyl, for derved å oppnå forbindelsen med formel (X) under.

Etter avbeskyttelse av produktet til (VII) gir metylering som diskutert over sluttproduktet, forbindelse I. Alternativt kan beskyttelsesgruppen slik som/ eks. etoksykarbonyl omdannes direkte til en metylgruppe ved å anvende et passende reduksjonsmiddel,/ eks. litiumaluminiumhydrid.

Under syntesen dannes noe ci^y-diastereoisomer av forbindelse I ( dvs. 4-((15',35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin) som en forurensning i sluttproduktet. Denne forurensning skyldes hovedsaklig dannelsen av noe av trans- fovmen av (VI) ( f. eks. ( IS, 3R)-3,5-diklor-l-fenylindan når LG er Cl) i trinnet hvor forbindelse VI dannes. Derfor kan forurensningen minimaliseres ved krystallisasjon av den ønskede cw-form av forbindelse VI, fra blandingen av trans og cis (VI); i tilfellet hvor LG er Cl i forbindelse VI kan dette gjøres ved omrøring av blandingen med et passende løsningsmiddel,/ eks. et alkan, slik som heptan, hvorved den ønskede cw-form av VI presipiterer og den uønskede trans- iotm av forbindelse VI går i løsning. Den ønskede cw-form av forbindelse VI ( f. eks. når LG er Cl) isoleres ved filtrering, vaskes med det aktuelle løsningsmiddel og tørkes.

Hvis cis-formen av forbindelse VI er til stede i batchen av (VI) anvendt i syntesen av forbindelse VII, vil dette gi opphav til dannelsen av trans- formen av forbindelse VII ( dvs. 4-((15',35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-3,3-dimetylpiperazin) som en forurensning i (VII); denne gir en andre mulighet for å unngå cw-formen av forbindelse I i sluttproduktet: Det har blitt funnet at cw-formen av forbindelse VII kan fjernes ved presipitasjon av et passende salt av forbindelsen med formel VII,/ eks. et salt av en organisk syre, slik som en organisk disyre, formålstjenlig hydrogenfumaratsaltet eller hydrogenmaleatsaltet av forbindelsen med formel (VII), eventuelt etterfulgt av én eller flere omkrystallisasjoner.

Videre har det blitt funnet at forurensninger i form av cw-diastereoisomer i (I) ( dvs. 4-((15',35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin) effektivt kan fjernes ved presipitasjon av et passende salt av forbindelsen med formel (I),/ eks. et salt av en organisk syre, slik som en organisk disyre, formålstjenlig et fumaratsalt,/ eks. hydrogenfumaratsaltet av forbindelsen med formel (I) eventuelt etterfulgt av én eller flere omkrystallisasjoner.

Oppfinnelsen vedrører i ytterligere aspekter også intermediatene som beskrevet heri for syntesen av forbindelsen med formel (I), dvs. spesielt intermediatene (Va), VI, f. eks. Via, og VII, eller salter av forbindelse VII. I denne sammenheng er det forstått at når den stereoisomere form spesifiseres, så er stereoisomeren hovedbestanddelen av forbindelsen. Spesielt, når den enantiomere form spesifiseres, så har forbindelsen et enantiomert overskudd av den aktuelle enantiomer.

Følgelig vedrører én utførelsesform av oppfinnelsen forbindelsen med formel (Va), som fortrinnsvis har et enantiomert overskudd på minst 60 % (60 % enantiomert overskudd betyr at forholdet av Va til dens enantiomer er 80:20 i den aktuelle blanding), minst 70 %, minst 80 %, minst 85 %, minst 90 %, minst 96%, fortrinnsvis minst 98 %. Videre er det diastereomere overskudd av forbindelsen fortrinnsvis minst 70 % (70 % diastereomert overskudd betyr at forholdet av forbindelse Va til (lR,3S)-6-klor-3-fenylindan-l-ol er 85:15 i den aktuelle blanding), minst 80 %, minst 85 %, minst 90 % eller minst 95 %. Én utførelsesform vedrører hovedsakelig ren forbindelse Va.

En ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen vedrører forbindelsen med formel (VI), som fortrinnsvis har et enantiomert overskudd på minst 60 %, minst 70 %, minst 80 %, minst 85 %, minst 90 %, minst 96 %, fortrinnsvis minst 98 %,

hvori LG er en mulig utgående gruppe, fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av et halogen,/ eks. klorid, eller et sulfonat. Én utførelsesform vedrører den diastereomere renhet av forbindelse VI; dvs. forbindelsen har et diastereomert overskudd på fortrinnsvis minst 10 % (10 % diastereomert overskudd betyr at forholdet av forbindelse VI til cis-diastereoisomeren ( f. eks. (lS,3R)-3,5-diklor-l-fenylindan når LG = Cl) er 55:45 i den aktuelle blanding), minst 25 % eller minst 50 %. Én utførelsesform vedrører hovedsaklig ren forbindelse VI. Følgelig vedrører oppfinnelsen også en forbindelse som har den følgende formel (Via),

som fortrinnsvis har et enantiomert overskudd på minst 60 %, minst 70 %, minst 80 %, minst 85 %, minst 90 %, minst 96 %, fortrinnsvis minst 98 %. Én utførelsesform vedrører den diastereomere renhet av forbindelsen, dvs. forbindelsen har et diastereomert overskudd på, fortrinnsvis minst 10 % (10 % diastereomert overskudd betyr at forholdet av forbindelsen til cis-diastereoisomeren, (lS,3R)-3,5-diklor-l-fenylindan, er 55:45 i den aktuelle blanding), minst 25 % eller minst 50 %. Én utførelsesform vedrører hovedsaklig ren forbindelse VI hvor LG er Cl.

som fortrinnsvis har et enantiomert overskudd på minst 60 % (60 % enantiomert overskudd betyr at forholdet av VII til dens enantiomer er 80:20 i den aktuelle blanding), minst 70 %, minst 80 %, minst 85 %, minst 90 %, minst 96 %, fortrinnsvis minst 98 %,

eller et salt derav, slik som,/ eks., et fumaratsalt,/ eks. hydrogenfumarat, eller et maleatsalt,/ eks. hydrogenmaleat. Én utførelsesform vedrører den diastereomere renhet av forbindelsen VII, dvs. forbindelsen har et diastereomert overskudd på fortrinnsvis minst 10 % (10 % diastereomert overskudd betyr at forholdet av forbindelse VII til cis-( lS, 3S) diastereoisomeren er 55:45 i den aktuelle blanding), minst 25 %, minst 50 %, minst 70 %, minst 80 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 97 %, minst 98 %. Én utførelsesform vedrører hovedsaklig ren forbindelse VII eller et salt derav.

Et ytterligere aspekt vedrører forbindelse I eller et salt derav, spesielt fumarat-, malonat-, eller succinatsaltet, oppnåelig, spesielt oppnådd, ved en fremgangsmåte av oppfinnelsen som beskrevet heri.

Et ytterligere aspekt vedrører forbindelse VII eller et salt derav, f. eks. fumaratsaltet, oppnåelig, spesielt oppnådd, ved en fremgangsmåte av oppfinnelsen som beskrevet heri.

De fysikalske egenskaper av forbindelsen I salter av oppfinnelsen indikerer at de vil være spesielt nyttige som et farmasøytikum.

Følgelig vedrører den foreliggende oppfinnelse ytterligere en farmasøytisk sammensetning av succinatsaltet, spesielt hydrogensuccinatsaltet som beskrevet heri (f. eks. alfa- eller beta-formen som beskrevet heri), eller av malonatsaltet, spesielt hydrogenmalonatsaltet, av forbindelsen med formel (I). Oppfinnelsen vedrører også den medisinske anvendelse av slike salter og sammensetninger, slik som for behandlingen av en sykdom i sentralnervesystemet, inklusive psykose, spesielt schizofreni eller andre sykdommer som involverer psykotiske symptomer, slik som,/ eks., schizofreni, schizofreniform lidelse, schizoaffektiv lidelse, vrangforestillingslidelse, kort psykotisk lidelse, delt psykotisk lidelse samt andre psykotiske lidelser eller sykdommer som fremviser psykotiske symptomer,/ eks. mani i bipolar lidelse.

I tillegg antyder den 5-HT₂-antagonistiske aktivitet av forbindelsen av oppfinnelsen at forbindelsen kan ha en relativt lav risiko for ekstrapyramidale bivirkninger.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av succinat- eller malonatsaltet av oppfinnelsen, fortrinnsvis hydrogensuccinat- ( f. eks. den krystallinske form alfa) eller hydrogenmalonatsaltet av forbindelsen med formel (I) for behandling av en sykdom valgt fra gruppen bestående av angstlidelser, affektive lidelser inklusive depresjon, søvnforstyr-relser, migrene, nevroleptikumindusert parkinsonisme, kokainmisbruk, nikotinmisbruk, alkoholmisbruk og andre misbrukslidelser.

I et bredt aspekt vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å behandle schizofreniform lidelse, schizoaffektiv lidelse, vrangforestillingslidelse, kort psykotisk lidelse, delt psykotisk lidelse eller mani i bipolar lidelse, omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen rrø_/w-4-(6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin eller et salt derav.

Som anvendt heri er begrepet "trans-4-(6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin", dvs. uten noen spesifikk indikasjon av enantiomerformen ( f. eks. ved å anvende (+) og (-), eller ved å anvende R/S-konvensjonen, ment å referere til enhver enantiomer form av denne forbindelse, dvs. hvilken som helst av de to enantiomerer, 4-((iÆ,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin (I) eller 4-((75',3/?)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin eller en blanding av de to, / eks. den racemiske blanding. Imidlertid er i denne sammenheng fortrinnsvis innholdet av enantiomeren tilsvarende den av forbindelse I minst 50 %, dvs. minst som den racemiske blanding, fortrinnsvis er forbindelse I i enantiomert overskudd.

I den foreliggende sammenheng for de farmasøytiske anvendelser er det forstått at når den enantiomere form av forbindelsen ?ra«5,-4-(6-klor-3-fenylindan-l -yl)-1,2,2-trimetylpiperazin ( f. eks. som gjort i formel (I)) spesifiseres, så er forbindelsen relativt stereokjemisk ren som beskrevet over, fortrinnsvis er det enantiomere overskudd minst 80 % (80 % enantiomert overskudd betyr at forholdet av I til dens enantiomer er 90:10 i den aktuelle blanding) minst 90 %, minst 96 %, eller fortrinnsvis minst 98 %. I en foretrukket utførelsesform er det diastereomere overskudd av forbindelse I minst 90 % (90 % diastereomer renhet betyr at forholdet av forbindelse I til cw-4-((lS,3S))-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin er 95:5), minst 95 %, minst 97 % eller minst 98 %.

I en foretrukket utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å behandle schizofreniform lidelse, schizoaffektiv lidelse, vrangforestillingslidelse, kort psykotisk lidelse, delt psykotisk lidelse eller mani i bipolar lidelse, omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen med formel (I) [dvs. 4-((l/?,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin] eller et salt derav.

Én utførelsesform av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å behandle positive symptomer på schizofreni, negative symptomer og depressive symptomer på schizofreni omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen _/ra_/w-4-(6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin eller et salt derav, fortrinnsvis forbindelsen med

formel (I) eller et salt derav, eller i en foretrukket utførelsesform et succinat- eller et malonatsalt av forbindelsen med formel (I), fortrinnsvis hydrogensuccinat- eller hydrogenmalonatsaltet av forbindelsen med formel (I).

En ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å behandle positive symptomer på schizofreni omfattende å administrere en terapeutisk effektiv

mengde av forbindelsen rra«_5'-4-(6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-tirmetylpiperazin eller et salt derav, fortrinnsvis forbindelsen med formel (I) eller et salt derav, eller i en foretrukket utførelsesform et succinat- eller et malonatsalt av forbindelsen med formel (I), fortrinnsvis hydrogensuccinat- eller hydrogenmalonatsaltet av forbindelsen med formel (I).

En annen utførelsesform av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å behandle negative symptomer på schizofreni omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen rra«_5'-4-(6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-tirmetylpiperazin eller et salt derav, eller fortrinnsvis forbindelsen med formel (I) eller et salt derav, eller i en foretrukket utførelsesform et succinat- eller et malonatsalt av forbindelsen med formel (I), fortrinnsvis hydrogensuccinat- eller hydrogenmalonatsaltet av forbindelsen med formel (I).

En ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å behandle depressive symptomer på schizofreni omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen rra«_5'-4-(6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-tirmetylpiperazin eller et salt derav, fortrinnsvis forbindelsen med formel (I) eller et salt derav, eller i en foretrukket utførelsesform hydrogensuccinat- eller malonatsaltet av forbindelsen med formel (I).

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å behandle mani

og/eller opprettholdelse av bipolar lidelse omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen rra«_5'-4-(6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-tirmetylpiperazin eller et salt derav, fortrinnsvis forbindelsen med formel (I) eller et salt derav, eller i en foretrukket utførelsesform et succinat- eller et malonatsalt av forbindelsen med formel (I), fortrinnsvis hydrogensuccinat- eller hydrogenmalonatsaltet av forbindelsen med formel (I).

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å behandle nevroleptikumindusert parkinsonisme omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen rra«_5'-4-(6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-tirmetylpiperazin eller et salt derav, fortrinnsvis forbindelsen med formel (I) eller et salt derav, eller i en foretrukket utførelsesform et succinat- eller et malonatsalt av forbindelsen med formel (I), fortrinnsvis hydrogensuccinat- eller hydrogenmalonatsaltet av forbindelsen med formel (I).

Oppfinnelsen vedrører ytterligere en fremgangsmåte for å behandle substansmisbruk,/ eks. nikotin-, alkohol- eller kokainmisbruk, omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen rra«_5'-4-(6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-tirmetylpiperazin eller et salt derav, fortrinnsvis forbindelsen med formel (I) eller et salt derav, eller i en foretrukket utførelsesform et succinat- eller et malonatsalt av forbindelsen med formel (I), fortrinnsvis hydrogensuccinat- eller hydrogenmalonatsaltet av forbindelsen med formel (I).

Et salt eller en sammensetning av oppfinnelsen kan administreres på enhver passende måte / eks. oralt, bukkalt, sublingvalt eller parenteralt, og saltet kan presenteres i enhver passende form for slik administrasjon,/ eks. i form av tabletter, kapsler, pulvere, siruper eller løsninger eller dispersjoner for injeksjon. I én utførelsesform administreres et salt av oppfinnelsen i form av en fast farmasøytisk enhet, formålstjenlig som en tablett eller en kapsel.

Fremgangsmåter for fremstillingen av faste farmasøytiske preparater er velkjente i faget.

Tabletter kan således fremstilles ved å blande den aktive ingrediens med vanlige adjuvantia, fyllstoffer og fortynningsmidler og deretter sammentrykning av blandingen i en konvensjonell tabletteringsmaskin. Eksempler på adjuvantia, fyllstoffer og fortynningsmidler omfatter maisstivelse, laktose, talkum, magnesiumstearat, gelatin, laktose, gummier, og lignende. Ethvert annet adjuvans eller additiv slik som fargestoffer, aroma, preservativer, etc. kan også anvendes forutsatt at de er kompatible med de aktive ingredienser.

Løsninger for injeksjoner kan fremstilles ved å lose et salt av oppfinnelsen og mulige additiver i en del av løsningsmidlet for injeksjon, fortrinnsvis sterilt vann, å justere løsningen til ønsket volum, sterilisering av løsningen og fylling i passende ampuller eller flasker. Ethvert passende additiv konvensjonelt anvendt i faget kan tilsettes, slik som tonisitetsmidler, preservativer, antioksidanter, løsningshjelpemidler etc.

Den daglige dose av forbindelsen med formel (I) over, beregnet som den frie base, er formålstjenlig mellom 1,0 og 160 mg/dag, mer passende mellom 1 og 100 mg,/ eks. fortrinnsvis mellom 2 og 55, eller mellom 3 og 55 mg.

Begrepet "behandling" som anvendt heri i forbindelse med en sykdom eller lidelser inkluderer også forebygging alt etter som.

Det enantiomere overskudd av forbindelse ( Va") i eksempel la bestemmes ved kiral HPLC ved å anvende en CHIRALCEL® OD-kolonne, 0,46 cm ID X 25 cm L, 10 um ved 40 °C. n-heksan/etanol 95:5 (vol/vol) anvendes som mobilfase ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min, deteksjon utføres ved å anvende en UV-detektor ved 220 nm.

Eluent: Bufferet MeOH/vann fremstilt som følger: 1,1 ml Et₃N satt til 150 ml vann, 10 % H₃P0₄(aq) tilsettes til pH = 7 og vann tilsettes til en total på 200 ml. Blandingen settes til l,81MeOH.

Det enantiomere overskudd av forbindelse ( Va") i eksempel lb bestemmes ved kiral HPLC ved å anvende en CHIRALPAK® AD-kolonne, 0,46 cm ID X 25 cm L, 10 um ved 21 °C. Heptan/etanol/dietylamin 89,9:10:0,1 (vol/vol/vol) anvendes som mobilfase ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min, deteksjon utføres ved å anvende en UV-detektor ved 220 nm.

Det enantiomere overskudd av forbindelse I bestemmes ved silikaglass kapillærelektroforese (CE) ved å anvende de følgende betingelser: kapillar: 50 um ID X 64,5 cm L, kjørebuffer: 1,25 mM P-cyklodekstrin i 25 mM natriumdihydrogenfosfat, pH 1,5, spenning: 16 kV, temperatur: 22 °C, injeksjon: 50 mbar i 5 sekunder, deteksjon: kolonnediodearray-deteksjon 192 nm, prøvekonsentrasjon: 500 ug/ml. I dette system har forbindelse I en retensjonstid på tilnærmet 33 min, og den andre enantiomer har en retensjonstid på tilnærmet 35 min.

' Fl NMR- spektere tas opp ved 500,13 MHz på et Bruker Avance DRX500-instrument eller ved 250,13 MHz på et Bruker AC 250-instrument. Kloroform (99,8 %D) eller dimetylsulfoksid (99,8 %D) anvendes som løsningsmidler, og tetrametylsilan (TMS) anvendes som intern referansestandard.

Cis / trans - forholdet av forbindelses I og VII bestemmes ved å anvende ^*H NMR som beskrevet i Bøgesø et al., J. Med Chem. 1995, 38, 4380-4392 (side 4388, høyre kolonne). Cis/ trans- forholdet av forbindelse VI bestemmes også ved ^!H NMR i kloroform, ved å anvende integralene av signalet ved 5,3 ppm for c/s-isomeren og signalet ved 5,5 ppm for _/røws-isomeren. Generelt kan et innhold på tilnærmet 1 % av den uønskede isomer detekteres ved NMR.

Pulverrøntgendiffraktogramer tas opp av et PANalytical XTert PRO røntgendiffraktometer ved å anvende CuK_ai-stråling. Det måles i refleksjonsmodus i 28-området 5-40°.

Smeltepunktene måles ved å anvende differensial skanningkalorimetri (DSC). Utstyret er et TA-Instruments DSC-2920 kalibrert ved 5°/min for å gi smeltepunktet som begynnelses-verdi. Ca 2 mg prøve varmes 5°/min i en løst lukket digel under nitrogenstrøm.

Forbindelse V ble syntetisert fra IV ved reduksjon med natriumborhydrid (NaBH₄) ved å tilpasse en metode beskrevet i Bøgesø J. Med. Chem. 1983, 26,935, ved å anvende etanol som løsningsmiddel, og ved å utføre reaksjonen ved omtrent 0 °C. Begge forbindelser er beskrevet i Bøgesø et al. J. Med. Chem. 1995, 38, 4380-4392. Forbindelse IV ble syntetisert fra II ved å anvende de generelle prosedyrer beskrevet i Sommer et al., J. Org. Chem. 1990, 55,4822, som også beskriver II og syntesen derav.

Eksempel la Syntese av (lS,3S)-6-klor-3-fenylindan-l-ol (Va) ved anvendelse av kiral

Racemisk cw-6-klor-3-fenylindan-l-ol (V) (492 g) oppløses ved preparativ kromatografi, ved å anvende en CHIRALPAK^® AD-kolonne, 10 cm ID X 50 cm L, 10 _fim ved 40 °C. Metanol anvendes som mobilfase ved en strømningshastighet på 190 ml/min, deteksjon utføres ved å anvende en UV-detektor ved 287 nm. Den racemiske alkohol (V) injiseres som en 50.000 ppm løsning i metanol; 90 ml injiseres med intervaller på 28 min. Alle fraksjonene som inneholder tittelforbindelsen med mer enn 98 % enantiomert overskudd, kombineres og inndampes til tørrhet ved å anvende en rotasjonsinndamper, etterfulgt av tørking "in vacuo" ved 40 °C. Utbytte 220 g som et fast stoff. Elementanalyse og NMR stemmer overensstemmelse med strukturen, det enantiomere overskudd er høyere enn 98 % i henhold til kiral HPLC, [a]_D²° +44,5° (c=l,0, metanol).

Eksempel lb Syntese av (lS,3S)-6-klor-3-fenylindan-l-ol (Va) ved anvendelse av

Forbindelse V (5 g, 20,4 mmol) løses i 150 ml vannfri toluen. 0,5 g Novozym 435 (Candida Antarctica lipase B) (Novozymes A/S, Fluka kat. nr. 73940) tilsettes etterfulgt av vinylbutyrat (13 ml, 102,2 mmol). Blandingen omrøres ved å anvende mekanisk rører ved 21 °C. Etter 1 dag tilsettes ytterligere 0,5 g Novozym 435. Etter 4 dager ved en konversjon på 54 % filtreres blandingen og konsentreres in vacuo for å oppnå en olje inneholdende en blanding av (IR, 3R)-cis-6-klor-3-fenylindan-l-ol-butyratester og ønsket forbindelse Va med et enantiomert overskudd på 99,2 % (99,6 % forbindelse Va og 0,4% (IR, 3R)-cis-6-klor-3-fenylindan- l-ol).

Syntese av (I) og fjerning av forurensningen i form av c/s-diastereoisomeren ved presipitasjon av hydrogenfumaratsaltet av (I)

Eksempel 2 Syntese av (lS^SH^-diklor-l-fenylindan (VI, LG = Cl) Cw-(lS,3S)-6-klor-3-fenylindan-l-ol (Va) (204 g) oppnådd som beskrevet i eksempel la løses i THF (1500 ml) og avkjøles til -5 °C. Tionylklorid (119 g) tilsettes dråpevis som en løsning i THF (500 ml) over en periode på 1 h. Blandingen omrøres ved romtemperatur natten over. Is (100 g) settes til reaksjonsblandingen. Når isen har smeltet, separeres vannfasen (A) og den organiske fase (B), og den organiske fase B vaskes to ganger med mettet natriumbikarbonat (200 ml). Natriumbikarbonatfasene kombineres med vannfase A, justeres til pH 9 med natriumhydroksid (28 %), og anvendes for å vaske den organiske fase B en gang til. Den resulterende vannfase (C) og den organiske fase B separeres, og vannfasen C ekstraheres med etylacetat. Etylacetatfasen kombineres med den organiske fase B, tørkes med magnesiumsulfat, og inndampes til tørrhet ved å anvende en rotasjonsinndamper, som gir tittelforbindelsen som en olje. Utbytte 240 g, som anvendes direkte i eksempel 5. Cis/ trans- forhold 77:23 i henhold til NMR.

Kaliumkarbonat (390 g) og etylendiamin (1001 g) omrøres med toluen (1,50 1). En løsning av etyl 2-bromisobutyrat (500 g) i toluen (750 ml) tilsettes. Suspensjonen varmes til refluks natten over og filtreres. Filterkaken vaskes med toluen (500 ml). De kombinerte filtrater (volum 4,01) varmes på et vannbad og destilleres ved 0,3 atm. ved å anvende et Claisen-apparat; først samles 1200 ml destillat ved 35 °C (temperaturen i blandingen er 75 °C). Mer toluen tilsettes (600 ml), og et annet 1200 ml destillat samles ved 76 °C (temperaturen i blandingen er 80 °C). Toluen (750 ml) tilsettes igjen, og 1100 ml destillat samles ved 66 °C (temperatur i blandingen 71 °C). Blandingen omrøres på et isbad og inokuleres, hvorved produktet presipiterer. Produktet isoleres ved filtrering, vaskes med toluen og tørkes natten over i en vakuumovn ved 50 °C. Utbytte 171 g (52 %) av 3,3-dimetylpiperazin-2-on. NMR samsvarende med struktur.

En blanding av 3,3-dimetylpiperazin-2-on (8,28 kg, 64,6 mol) og tetrahydrofuran (THF) (60 kg) varmes til 50-60 °C som gir en lett uklar løsning. THF (50 kg) omrøres under nitrogen, og L1AIH₄ (250 g, i en løselig plastpose, fra Chemetall) tilsettes, som gir en langsom utvikling av gass. Etter at gassutvikling har opphørt tilsettes mer OAIH4 (total 3,0 kg, 79,1 mol, anvendes), og temperaturen stiger fra 22 °C til 50 °C på grunn av en eksoterm. Løsningen av 3,3-dimetylpiperazin-2-on tilsettes langsomt over 2 timer ved 41-59 °C. Suspensjonen omrøres i en ytterligere time ved 59 °C (kappetemperatur 60 °C). Blandingen avkjøles, og vann (3 1) tilsettes over to timer, hvilket holder temperaturen under 25 °C (det er nødvendig å avkjøle med en kappetemperatur på 0 °C). Deretter tilsettes natriumhydroksid (15 %, 3,50 kg) over 20 minutter ved 23 °C, avkjøling nødvendig. Mer vann (9 1) tilsettes over en halv time (avkjøling nødvendig), og blandingen omrøres natten over under nitrogen. Filtreringsmiddel Celite (4 kg) tilsettes, og blandingen filtreres. Filterkaken vaskes med THF (40 kg). De kombinerte filtrater konsentreres i reaktoren inntil temperaturen i reaktoren er 70 °C (destillasjonstemperatur 66 °C) ved 800 mbar. Resten (12,8 kg) konsentreres ytterligere på en rotavapor til omtrent 101. Til sist destilleres blandingen fraksjonelt ved atmosfærisk trykk, og produktet samles ved 163-4 °C. Utbytte 5,3 kg (72 %). NMR i samsvar med strukturen.

Eksempel 5 Syntese av _/rc»s-l-((lif,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-3,3-dimetylpiperazin (VII)

Cw-(;S3S>3,5-dMor-l-fenylindan (VI, LG = Cl) (240 g) løses i butan-2-on (1800 ml). Kaliumkarbonat (272 g) og 2,2-dimetylpiperazin (fremstilt i eksempel 4) (113 g) tilsettes og blandingen varmes ved reflukstemperatur i 40 h. Til reaksjonsblandingen tilsettes dietyleter (2 1) og saltsyre (1 M, 6 1). Fasene separeres, og pH i vannfasen senkes fra 8 til 1 med konsentrert saltsyre. Vannfasen anvendes for å vaske den organiske fase en gang til for å sikre, at alt produkt er i vannfasen. Natriumhydroksid (28 %) settes til vannfasen inntil pH er 10, og vannfasen ekstraheres to ganger med dietyleter (2 1). Dietyleterekstrakter kombineres, tørkes med natriumsulfat, og inndampes til tørrhet ved å anvende en rotasjonsinndamper. Utbytte 251 g av tittelforbindelsen som en olje, som anvendes direkte i det neste eksempel. Cis/ trans- forhold, 82:18 i henhold til NMR.

Eksempel 6 Syntese av trans- 4-(( lR, 3S)- 6- klor- 3- feny\ indan- l- y\)- l, 2, 2-trimetylpiperazinium (I) hydrogenfumarat

Ubearbeidet _/ra«₅-l-((l/?,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-3,3-dimetylpiperazin (VII) (250 g) blandes med formaldehyd (37 % i vann, 300 ml) og maursyre (366 g), og blandingen varmes langsomt til refluks. Blandingen omrøres ved refluks i 3,5 timer, og etter avkjøling til romtemperatur tilsettes vann (1200 ml). Blandingen ekstraheres to ganger med eter (1200 ml), og deretter gjøres vannfasen alkalisk ved å tilsette natriumhydroksid (28 %, omtrent 500 ml). Vannfasen ekstraheres tre ganger med eter (900 ml). De organiske faser kombineres og vaskes med saltløsning (650 ml) og to ganger med vann (500 ml). Den organiske fase tørkes av natriumsulfat, filtreres og inndampes til tørrhet på en rotasjonsinndamper. Utbytte: 212 g av _^^^-((i^i^-e-klor-S-fenylindan-l-yl)-1,2,2-trimetylpiperazin fri base (I) som en olje, med 19 % av cis-diastereoisomeren i henhold til NMR. Forbindelsen løses i 1-propanol (3,18 1) og blandingen varmes til 50 "C, som gir en klar løsning. Fumarsyre (69,3 g) tilsettes, hvilket gir en klar løsning. Blandingen tillates å avkjøle, hvorved tittelforbindelsen presipiterer. Produktet isoleres ved filtrering, vaskes med 1-propanol og tørkes "in vacuo" ved 60 ^*C. Utbytte: 182 g, inneholder <1% av cis-diastereoisomeren i henhold til NMR. Elementanalyse og NMR er i overensstemmelse med strukturen. Det enantiomere overskudd er høyere enn 99 % i henhold til kiral kapillærelektroforese (CE). [a]_D^20=-22,8° (c=l,0, metanol).

Frigjøring av det frie amin av (I) fra hydrogenfumaratsaltet og ny presipitasjon som hydrogensuccinat- og hydrogenmalonatsalter

Eksempel 7 Syntese av 4-((i/?,55)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazm

fri base (I)

Trans- 4-((l/?,35)-6-klor-3-fenylindan-1 -yl)-1,2,2-trimetylpiperazinium (I) hydrogenfumarat (25,0 g) suspenderes i toluen (125 ml). Vandig ammoniakk 25 % (75 ml) tilsettes. De tre faser omrøres inntil alle faste stoffer har forsvunnet. Den organiske fase separeres, og den vandige fase vaskes med toluen (25 ml). De kombinerte toluenfaser vaskes med vann (25 ml). Den vandige fase kastes og den organiske fase tørkes av natriumsulfattørkemiddel (35

g), slurryen filtreres og filtratet inndampes til tørrhet på en rotasjonsinndamper, hvilket gir tittelforbindelsen som en olje. Den ubearbeidede frie base (15 g) anvendes uten ytterligere

Eksempel 8 Syntese av _/rc»s-4-((lif,55)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetyl-piperazinium (I) hydrogensuccinat

Ubearbeidet _/ra«₅,-4-((l/?,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin (I) (8,50 g olje) oppnådd som beskrevet i eksempel 7 løses i aceton (30 ml). En suspensjon av ravsyre (3,25 g) i aceton (32 ml) fremstilles og _/ra«₅-4-((l/?,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin (I)-løsningen tilsettes, ravsyren løser seg og kort tid deretter presipiterer trans- A-(( l/?,35)-6-klor-3 -fenylindan-1 -yl)-1,2,2-trimetylpiperazinium (I) hydrogensuccinatet. Suspensjonen avkjøles til 0 °C i 90 minutter før presipitatet isoleres ved sentrifugering. Supernatanten kastes og presipitatet vaskes med aceton (20 ml). Slurryen sentrifugeres og supernatanten kastes og presipitatet tørkes "in vacuo" ved 50 ^*C. Utbytte 8,56 g.

Da denne prosedyre ble utført første gangen var det isolerte produkt beta-formen, etterfølgende repetisjoner resulterte i dannelse av den mer stabile alfa-form av forbindelse I hydrogensuccinat.

Aceton i det over beskrevne eksperiment kan byttes med vandig aceton (95 %) som også resulterer i dannelse av alfa-formen av forbindelse I hydrogensuccinat.

Differensial skanningkalorimetri (DSC) viser en endoterm med en begynnelsestemperatur på 140 °C og en topp ved 141 °C tilsvarende alfa-formen. XRPD-diffraktogram er i overensstemmelse med alfa-formen.

Eksempel 9 rra_/is-4-((l/?,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazinium (I)

Ubearbeidet /ra«s-4-((l/?,3SV6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin (I) (1,0 g, 2,81 mmol, oppnådd som beskrevet i eksempel 7 løses i 2-propanol (5 ml). En løsning av malonsyre (0,291 g, 2,46 mmol) i 2-propanol (5 ml) fremstilles og trans- 4-(( lR, 3S)- 6-\ dor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazinløsningen tilsettes, hvorved trans- 4-(( lR, 3S)- 6-klor-3-fenylindan-1 -yl)-1,2,2-trimetylpiperazinium-hydrogenmalonatet presipiterer. Suspensjonen avkjøles til romtemperatur før presipitatet isoleres ved sentrifugering. Supernatanten kastes og presipitatet vaskes med 2-propanol (5 ml). Slurryen sentrifugeres og supernatanten kastes og presipitatet tørkes "in vacuo" ved 50 ^*C. Utbytte: 0,98 g (84 %). Elementanalyse er i overensstemmelse med strukturen. Røntgendiffraktogramet er i overensstemmelse med diffraktogramet av hydrogenmalonatet som vist i figur 3.

Syntese av (I), saltdannelse av (VII) for å fjerne c/s-diastereoisomer av (VII), og dannelse av hydrogensuccinatsaltet fra ubearbeidet (I)

Eksempel 10 Syntese av _fra»s-l-((lÆ,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-3,3-dimetylpiperazinium (VII) hydrogenmaleat

Eksempel 2 og 5 gjentas, hvilket gir ubearbeidet _/rø_/rø-l-((lÆ,3S)-6-klor-3-fenylindan-l-yi)-3,3-dimetylpiperazin (VII) (ca. 20 g) som en olje, hvilken renses ytterligere ved flash-kromatografi på silikagel (eluent: etylacetat/etanol/trietylamin 90:5:5) etterfulgt av inndamping til tørrhet på en rotasjonsinndamper. Utbytte 12 g av tittelforbindelsen som en olje ( cis/ trans- ioiholå, 90:10 i henhold til NMR). Oljen løses i etanol (100 ml), og til denne løsning tilsettes en løsning av maleinsyre i etanol til pH 3. Den resulterende blanding omrøres ved romtemperatur i 16 timer, og det dannede presipitat samles ved filtrering. Etanolvolumet reduseres og en annen batch med presipitat samles. Utbytte 3,5 g fast stoff av tittelforbindelsen (ingen cis-isomer detekteres i henhold til NMR). Smeltepunkt 175-178 °C.

En blanding av trans-l-((l/?,35')-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-3,3-dimetylpiperazinium-hydrogenmaleat (VII) (9,9 g), konsentrert vandig ammoniakk (100 ml), saltløsning (150 ml) og etylacetat (250 ml) omrøres ved romtemperatur i 30 min. Fasene separeres, og den vandige fase ekstraheres med etylacetat en gang til. De kombinerte organiske faser vaskes med saltløsning, tørkes over magnesiumsulfat, filtreres og inndampes til tørrhet in vacuo. Utbytte 7,5 g olje.

Eksempel 12 Fremstilling av _fra»s-4-((l/?,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin fri base (I)

Tra_/j_^-l-^l/J_jSiS^-é-klor-S-fenylindan-l-y^-S_jS-dimetylpiperazin (8,9 g) (VII) løses i maursyre (10,5 ml) og til løsningen tilsettes formaldehyd (10,5 ml). Varmes til 60 °C og holdes ved denne temperatur i 2lA time. Etter avkjøling av reaksjonsblandingen tilsettes vann (50 ml) og heksan (50 ml). Justering av pH med NaOH (27 %, 33 ml) til pH > 12. Heksanfasen vaskes med aq. NaCl (20 ml) og vann (20 ml). Heksan byttes azeotropisk med aceton (90 ml) og blandingen konsentreres. Den ubearbeidede frie base i aceton (10 ml) anvendes uten ytterligere rensing.

Eksempel 13 Trc/is-^^l/J^^-é-klor-S-fenylindan-l-ylJ-ljljl-trimetylpiperazinium (I)

Ubearbeidet /ra«5-4-((l/?,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trirnetylpiperazin (I) i aceton-løsning (10 ml). En suspensjon av ravsyre (3,4 g) i aceton (20 ml) fremstilles og /ra«5,-4-((l/?,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazin (I)-løsningen tilsettes og blandingen varmes til refluks (55 °C). Ravsyren løses og under avkjøling av løsningen begynner /ra«5,-4-((l/?,35,)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazinium (I) hydrogensuccinat å presipitere. Suspensjon etterlates natten over for å presipitere. Trans- 4-((l/?,35)-6-klor-3-fenylindan-1 -yl)-l ,2,2-trimetylpiperazinium-hydrogensuccinat isoleres ved filtrering og vaskes med aceton (20 ml). Produktet tørkes "in vacuo" ved 60 °C. Utbytte: 7,9 g.

Differensial skanningkalorimetri viser en endoterm med en begynnelsestemperatur på 140 °C og en topp ved 141 °C som tilsvarer alfa-formen. XRPD-diffraktogram er i overensstemmelse med alfa-formen. [a]_D^20=-22,04° (c=l,0, metanol).

3,3-dimetylpiperazin-2-on (50 g) suspenderes i 1,2-dimetoksyetan (DME) (150 ml) og kaliumkarbonat (70 g) tilsettes. Metyljodid (66,4 g) tilsettes i løpet av en halv time, mens blandingen avkjøles litt, hvilket tillater temperaturen å nå 50 °C. Blandingen omrøres 9 timer i et oljebad ved 40-45 °C, og en prøve tas ut for NMR, som indikerer, at det fremdeles er 8 % utgangsmateriale tilbake (signal ved 2,8 ppm). Mer metyljodid tilsettes (4,6 g), og blandingen omrøres i ytterligere 2Vi time ved 40 °C, og en ny NMR-prøve viser full konversjon. Blandingen filtreres og filterkaken vaskes med DME. Filtratet inndampes til tørrhet hvilket gir 41 g av tittelforbindelsen. NMR stemmer overens med strukturen.

En løsning av litiumaluminiumhydrid i tetrahydrofuran (THF) (1,0 M, Aldrich kat. nr. 21.277-6, 90 ml) varmes til 50 °C på et oljebad. Ubearbeidet 3,3,4-trimetylpiperazin-2-on (10 g) suspenderes i THF og tilsettes langsomt, hvilket gir gassutvikling. Den resulterende blanding omrøres ved 45-56 °C i 4 timer, hvilket gir full konversjon til tittelforbindelsen i henhold til NMR (intet signal ved 1,2 ppm fra utgangsmateriale). Blandingen avkjøles og vann (3,3 ml) tilsettes, hvilket gir gassutvikling. Deretter tilsettes en løsning av natriumhydroksid i vann (15 %, 3,3 ml), som gir mer gass, og til sist tilsettes vann (10 ml). Blandingen filtreres og filterkaken vaskes med THF (100 ml). Filtratene konsentreres på en rotasjonsinndamper (0,3 atm. og 60 °C i vannbadet). Residuet løses i THF (200 ml) og tørkes med natriumsulfat, deretter filtreres blandingen og filtratet konsentreres på en rotasjonsinndamper (0,2 atm og 60 °C i vannbadet) hvilket gir 6,4 g av tittelforbindelsen. NMR stemmer overens med strukturen, substansen inneholder noe THF.

Eksempel 16 Syntese av _frc_/fs-4-((lÆ,35)-6-klor-3-fenylindan-l-yl)-l,2,2-trimetylpiperazinium (I) hydrogenfumarat fra forbindelse VI

Cw-(;£3S>3,5-dMor-l-fenylindan (VI med LG = Cl) (17,8 g) kobles med destillert 1,2,2-trimetylpiperazin (VIII) (8,7 g) ved å anvende prosedyren beskrevet i eksempel 5. Rå-produktet av det frie amin (15,7 g), inneholdende 6 % av cis-isomeren, anvendes for å danne hydrogenfumaratsaltet ved å anvende prosedyren i eksempel 6. Utbytte 15,7 g av tittelforbindelsen; NMR stemmer overens med strukturen, ingen cw-isomer observeres.

Eksempel 17 Syntese av _fra»s-4-((i/?,55)-6-klor-3-fenyUndan-l-yl)-l,2,2-trimetyl-piperazinium (I) hydrogensuccinat, beta-form

Forbindelse I hydrogensuccinat (50 mg) suspenderes i vann (1 ml) og tillates å ekvilibrere i 3 dager. Alt uløst materiale fjernes ved filtrering. Beta-formen av forbindelse I hydrogensuccinat dannes i løpet av den naturlige fordamping av løsningsmidlet. Beta-formen analyseres etter full inndamping av løsningsmidlet ved XRPD og DSC.

Analytiske resultater: differensial skanningkalorimetri (DSC) viser en endoterm med en begynnelsestemperatur på 135,6 °C og en topp ved 137,5 °C tilsvarende beta-formen. XRPD stemmer overens med beta-formen.

Saltenes løselighet i vann ble bestemt ved å tilsette et overskudd (50 mg) av salt til 2 ml vann. Suspensjonene ble etterlatt ved rotasjonsblanding i minst 24 timer, og deretter ble pH målt og konsentrasjonen ble bestemt ved HPLC. Det faste presipitat ble isolert og etterlatt for å tørke på laboratoriet. Resultatene er summert i tabell 1.

Varme, 60 °C/80 %RH: Prøver ble lagret ved 60 °C med 80 %RH i én uke. Deretter ble de løst og analysert ved HPLC.

Varme, 90 °C: Prøver (_~10 mg) ble lagret ved 90 °C i lukkede beholdere inneholdende 1 dråpe vann. Deretter ble de løst og analysert ved HPLC.

Lys: Prøver ble plassert i lyskabinettet ved 250 w/m² i 24 timer. Deretter ble de løst og analysert ved HPLC.

Arealet av topper i kromatogrammene bortsett fra toppene tilsvarende substansen eller syren ble summert. Succinatsaltet av oppfinnelsen viser ikke noen degradering i det hele tatt.

Hygroskopisitet av fumaratsaltet, succinatsaltet (alfa-formen) og malonatsaltet ble undersøkt ved dynamisk dampsorpsjon (DVS). Fumarat- og succinatsaltene ble funnet å være ikke-hygroskopiske. Malonatet absorberer gradvis opp til 1 % vann når den relative fuktighet heves til 95 %, men uten hysterese.