Viktig informasjon i saken hentes i sanntid direkte fra EPO sitt register (European Patent Register), slik at du enkelt og raskt får oversikt i saken.
Beskrivelse Verdi
Saken / databasen er sist oppdatert info  
Tittel Benzoksazinoner som inhibitorer av HIV-revers transkriptase
Status
Hovedstatus
Detaljstatus
Ikke i kraft info Patent opphørt Utløpt etter 20 år
Patentnummer 304886
Søknadsnummer 19950424
Levert
Prioritet 1992.08.07, US 926607, .... se mer/flere nedenfor
Sakstype PCT
Internasjonal søknadsdato
Internasjonalt søknadsnummer PCT/US1993/07376
Videreført
Løpedag
Utløpsdato
Allment tilgjengelig
Meddelt
Søker Merck & Co Inc (US)
Innehaver Merck & Co Inc (US)
Oppfinner Steven D. Young (US) .... se mer/flere nedenfor
Fullmektig ZACCO NORWAY AS (NO)
Supplerende beskyttelsessertifikat(SPC) 2000004   2008008  
Patentfamilie Se i Espacenet

Visse benzoksazinoner av formel (I), hvori: X er halogen, X1 er trihalometyl eller pentahaloetyl, Z er 0, er anvendbare ved inhibering av HIV-revers transkriptase (innbefattende dens resistente varianter), forhindring eller behandling av HIV-infeksjon og behandling av AIDS, enten som forbindelser, farmasøytisk akseptable salter, farma-søytiske preparatbestanddeler, eventuelt i kombinasjon med andre antivirale midler, immunmodulatorer, antibiotika eller vaksiner. Metoder for behandling av AIDS og metoder for forhindring eller behandling av HIV-infeksjon er også beskrevet.

Se forsidefigur og sammendrag i Espacenet


B1

Beskrivelse

Bakgrunn for oppfinnelsen

Et retrovirus betegnet som humant immunsvekkelsesvirus (HIV), er det etiologiske middel for den komplekse syk-dom som innbefatter progressiv destruksjon av immunsystemet (ervervet immunsvekkelsessyndrom; AIDS) og degenerering av det sentrale og perifere nervesystem. Dette virus var tidligere kjent som LAV, HTLV-III eller ARV. Et fellestrekk ved retro-virusreplikasjon er revers transkripsjon av RNA-genomet med en viralt kodet revers transkriptase for å danne DNA-kopier av HIV-sekvenser, et nødvendig trinn i viral replikasjon. Det er kjent at enkelte forbindelser er revers transkriptaseinhibi-torer og er effektive midler ved behandling av AIDS og lign-ende sykdommer, f.eks. azidotymidin eller AZT.

Nukleotidsekvensering av HIV viser nærvær av et pol-gen i en åpen leseramme [Råtner, L. et al., Nature, 313, 277

(1985)]. Aminosyresekvenshomologi viser at pol-sekvensen koder for revers transkriptase, en endonuklease og en HIV-protease [Toh, H. et al., EMBO J. 4, 1267 (1985); Power, M.D. et al., Science, 231, 1567 (1986); Pearl, L.H. et al., Nature 329, 351

(1987)].

Søkeren har vist at forbindelsene ifølge oppfinnelsen er inhibitorer av HIV-revers transkriptase. De særlige for-deler ved foreliggende forbindelser er deres utviste inhibering av resistent HIV-revers transkriptase.

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

Forbindelser av formel I som her definert, er beskrevet. Disse forbindelser er anvendbare ved inhibering av HIV-revers transkriptase (og dens resistente varianter), forhindring av HIV-infeksjon, behandling av infeksjon med HIV og ved behandling av AIDS og/eller ARC, enten som forbindelser, farmasøytisk akseptable salter (hvor dette er egnet), farma-søytiske preparatbestanddeler, eventuelt i kombinasjon med andre antivirale midler, anti-infeksjonsmidler, immunmodulatorer, antibiotika eller vaksiner. Metoder for behandling av AIDS, metoder for forhindring av HIV-infeksjon og metoder for behandling av infeksjon med HIV er også beskrevet.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen og foretrukne utførel-ses f ormer

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser som er kjennetegnet ved formelen:

hvori:

X er halogen;

XI er trihalometyl;

Z er 0;

R er

(a) Cj.g-alkyl, usubstituert eller substituert med A, og A er halogen, C3.6-sykloalkyl, CN, hydrok-sy, C^-alkoksy, fenyl, C^-C^-alkyl, C^-Qi-alkok-sykarbonyl, nitro, diCC^-alkyl)amino, pyrrolidin, oksazolidinon eller fenyltio; (b) C2.4-alkenyl, usubstituert eller substituert med (i) A, eller

(ii) fenyl, usubstituert eller substituert med

A;

(c) C2.5-alkynyl, usubstituert eller substituert med (i) A, eller

(ii) fenyl, usubstituert eller substituert med

A;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Oppfinnelsen omfatter også et farmasøytisk preparat som er kjennetegnet ved at det omfatter en effektiv mengde av en forbindelse av formel II

og en farmasøytisk akseptabel bærer,hvori

X er halogen;

XI er trihalometyl; C2_5-alkyl; C3.5-sykloalkyl; eller

fenyl;

Z er 0 eller S;

R er

(a) Ci.g-alkyl, usubstituert eller substituert med A, og A er halogen, C3_6-sykloalkyl, CN, hydrok-sy, C1.4-alkoksy, fenyl, C^-Cj-alkyl, C^-C^-alkok-sykarbonyl, nitro, di(C1.2-alkyl )amino, pyrrolidin, oksazolidinon eller fenyltio; (b) C2_4-alkenyl, usubstituert eller substituert med (i) A, eller

(ii) fenyl, usubstituert eller substituert med

A;

(c) C2.5-alkynyl, usubstituert eller substituert med (i) A, eller

(ii) fenyl, usubstituert eller substituert med

A;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Foretrukne forbindelser innbefatter forbindelsene 37,2, 4, 2, 5 og 24 i tabell I nedenfor, i en rekkefølge med avtagende preferansegrad. Disse forbindelser har følgende struktur:

Forbindelse 37,2:(-)-6-klor-4-syklopropyletynyl-4-trifluormetyl-l,4-dihydro-2H-3, l-benzoksazin-2-on, den mest foretrukne;

Forbindelse 4:

(-)-6-klor-4-fenyletynyl-4-trifluormetyl-l,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazin-2-on;

Forbindelse 2:

(+/-)-6-klor-4-(2-cyanofenyl)etynyl-4-(1,1,1-trifluormetyl)-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on;

Forbindelse 5:

(+/-)-4-(1-klor-1,1-di fluormetyl)-4-(2-fenyletyny1)-6-klor-1, 4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on;

Forbindelse 24:

(+/-)-4-(2-[dimetylaminomety1]etyny1)-4-tri fluormetyl-6-klor-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er spesifikt illus-trert i tabellene I og II i det etterfølgende:

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha asymmetriske sentre og kan foreligge, bortsett fra når det er angitt spesifikt, som racemater, racemiske blandinger eller som individuelle diastereomerer, eller enantiomerer, hvor alle isomere former er innbefattet innen foreliggende oppfinnelse. Uttrykket (+/-) er beregnet på å omfatte (+) optiske isomerer eller (-) optiske isomerer eller blandinger derav.

Når enhver variabel (f.eks. R) oppstår mer enn én gang i enhver bestanddel eller i formel I, er dens definisjon ved hver forekomst uavhengig av dens definisjon ved hver annen forekomst. Kombinasjoner av substituenter og/eller variabler er også mulig bare hvis slike kombinasjoner resulterer i sta-bile forbindelser.

Som anvendt her, med mindre annet er angitt, er "alkyl" beregnet på å innbefatte både forgrenede og rettkjedede, mettede, alifatiske hydrokarbongrupper med det spesi-fiserte antall karbonatomer; "alkenyl" er beregnet på å dekke både forgrenede og rettkjedede alkylgrupper med minst én karbon-karbon-dobbeltbinding; "alkynyl" er beregnet på å dekke både forgrenede og rettkjedede alkylgrupper med minst én karbon-karbon-trippelbinding. "Halogen" eller "halo" som anvendt her, betyr fluor, klor, brom og jod.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres ved følgende metoder.

Ved syntesen av benzoksazinene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter den generelle metode typisk syklisering på en benzenkjerne som et sluttrinn. Se reaksjonsskjerna I. Aminogruppen av parakloranilin beskyttes først med f.eks. pivaloylklorid under dannelse av 2. Andre mindre foretrukne aminobeskyttende grupper innbefatter t-butoksykarbonyl-, ace-tat- eller isovaleroylgrupper. Ca. 2 ekvivalenter av et alkyl-litium omsettes deretter med 2, fortrinnsvis n-butyllitium. Ingen andre organometalliske forbindelser er egnet for dette metalleringstrinn. Etterfølgende omsetning med CF3COOEt etterfulgt av stansing av reaksjonen, gir 3.

Syntesen av den tertiære karbinol 4 finner deretter sted ved Grignard-addisjon til ketonet av 3. Grignard-reagen-set må være et salt av et divalent kation, f.eks. Mg++ eller Zn++. Monovalente kationer er funnet å være uegnet, slik som Li+ eller Na+. Egnede løsningsmidler innbefatter, men er ikke begrenset til, THF eller eter. Et vidt område av temperatur-betingelser er mulig mellom ca. 0°C og ca. romtemperatur.

Ringlukning for å gi forbindelsene ifølge oppfinnelsen 5_ utføres med kondenseringsmidler slik som 1,1' -karbonyldiimidazol, fosgen, dimetylkarbonat, difenylkarbonat eller di-(paranitrofenyl)karbonat. Syklisering kan utføres med enhver av disse forbindelser, så vel som et stort antall andre.

Et spesifikt tilfelle for reaksjonsskjerna I er angitt i reaksjonsskjerna IA. Det viser syntesen av L-741.211 som er et racemat av forbindelse 37,2, som ytterligere tilveiebrakt i eksempel 6.

Reaksjonsskjerna II angir en metode for derivatisering av acetylensubstitusjoner ved 4-stillingen av benzoksazinkjer-nen. Eksempelvis metalliseres forbindelse 6, og et sinksalt tilsettes deretter. I Heck-reaksjonen anvendes katalysatoren tetrakis-(trifenylfosfin)palladium(0) kompleksdannet med Cul for å gi 7.

Reaksjonsskjema III illustrerer substitusjon av en 4-acetylengruppe med en N-holdig heterosyklus. Mannich-reaksjonen innbefatter en kondensasjonsreaksjon av formaldehyd med heterosyklusen, f.eks. pyrrolidin. Substitusjon på det termin-ale karbon skjer deretter i nærvær av Cul som katalysator.

Reaksjonsskjerna IV illustrerer oppløsning av optiske isomerer av forbindelsene av formel I eller formel II. I dette eksempel er (-)-kamfansyre det oppløsende middel. Et stort antall andre oppløsningsmidler er egnet, innbefattende 0-metyl-mandelsyreklorid eller Moshers reagens. Det vil være innlysende for fagmannen hvordan slike isomerer separeres. Reaksjonsskjerna IVA er spesifikt tilpasset til opp-løsningen av L-741.211 ved isolering av L-743.726. Se reak-sjonssk jerna IVA og eksempel 6.

Syklopropylacetylen fremstilles ved reaksjonsskjerna V i henhold til publiserte prosedyrer, f.eks. CE. Hudson et al., J. Am. Chem. Soc. 94, 1158 (1972) og W. Schoberth et al., Synthesis, 703 (1972).

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er anvendbare ved fremstilling og utøvelse av screeningsutprøvninger for antivirale forbindelser. Eksempelvis er forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendbare for isolering av enzymmutanter som er glimrende screeningsverktøy for mer kraftfulle antivirale forbindelser. Enn videre er forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendbare ved etablering eller bestemmelse av det bindende sete av andre antivirale midler overfor HIV-revers transkriptase, f.eks. ved konkurrerende inhibering. Således er forbindelsene ifølge oppfinnelsen kommersielle produkter som skal selges for disse formål.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er anvendbare ved inhibering av HIV-revers transkriptase, forhindring eller behandling av infeksjon av humant immunsvekkelsesvirus (HIV) og behandling av derpå følgende patologiske tilstander slik som AIDS. Behandling av AIDS eller forhindring eller behandling av infeksjon med HIV er definert som å innbefatte, men er ikke begrenset til, behandling av et stort område av tilstander av HIV-infeksjon: AIDS, ARC (AIDS-relatert kompleks), både symp-tomatisk og asymptomatisk, og reell eller potensiell eksponering overfor HIV. Eksempelvis er forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendbare ved behandling av HIV-infeksjon etter mis-tenkt tilbakelagt eksponering overfor HIV, f.eks. ved blod-transfusjon, utbytting av kroppsvæsker, bitt, tilfeldige nåle-stikk eller eksponering overfor pasientblod under kirurgi.

Den spesielle fordel ved forbindelsene ifølge oppfinnelsen er deres sterke inhibering overfor HIV-revers transkriptase som er gjort resistent overfor andre antivirale midler, slik som L-697.661, som er 3-([(4,7-diklor-l,3-benzoksa-zol-2-yl)metyl]-amino)-5-etyl-6-metylpyridin-2(lH)-on; eller L-696.229, som er 3-[2-(1,3-benzoksazol-2-yl)etyl]-5-etyl-6-metylpyridin-2(lH)-on; eller AZT.

For disse formål kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen administreres oralt, parenteralt (innbefattende subkutane injeksjoner, intravenøs, intramuskulær, intrasternal injeksjon eller infusjonsteknikker), ved inhaleringsspray, eller rektalt, i doseringsenhetsformuleringer inneholdende konvensjon-elle, ikke-toksiske, farmasøytisk akseptable bærere og adju-vanser.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således ytterligere tilveiebrakt et farmasøytisk preparat for behandling av HIV-infeksjon og AIDS.

Disse farmasøytiske preparater kan være i form av oralt administrerbare suspensjoner eller tabletter; nasal-sprayer; sterile, injiserbare preparater, f.eks. som sterile, injiserbare, vandige eller oljeaktige suspensjoner eller stikkpiller.

Når de administreres oralt som en suspensjon, fremstilles disse preparater i henhold til teknikker velkjente innen det farmasøytiske fag, og kan inneholde mikrokrystallinsk cellulose for å tilføre masse, alginsyre eller natrium-alginat som et suspenderingsmiddel, metylcellulose som en vis-kositetsforøker, og søtningsmidler/smaksgivende midler kjent innen faget. Som tabletter med umiddelbar frigivelse kan disse preparater inneholde mikrokrystallinsk cellulose, dikalsium-fosfat, stivelse, magnesiumstearat og laktose og/eller andre eksipienser, bindemidler, ekstendere, oppbrytende midler, for-tynningsmidler og smøremidler kjent innen faget.

Når de administreres som nasal aerosol eller ved in-halering, fremstilles disse preparater i henhold til teknikker velkjente innen det farmasøytiske fag, og kan fremstilles som løsninger i saltvann, under anvendelse av benzylalkohol eller andre egnede konserveringsmidler, absorpsjonsaktivatorer for å øke biotilgjengeligheten, fluorkarboner og/eller andre opp-løseliggjørende eller dispergerende midler kjent innen faget.

De injiserbare løsninger eller suspensjoner kan for-muleres i henhold til kjent teknikk under anvendelse av egnede, ikke-toksiske, parenteralt akseptable fortynningsmid-ler eller løsningsmidler, slik som mannitol, 1,3-butandiol, vann, Ringers løsning eller isotonisk natriumkloridløsning, eller egnede dispergerings- eller fukte- og suspenderingsmid-ler, slik som sterile, milde fettoljer innbefattende syntetiske mono- eller diglyserider, og fettsyrer innbefattende oljesyre.

Når de administreres rektalt i form av stikkpiller, kan disse preparater fremstilles ved blanding av legemidlet med en egnet ikke-irriterende eksipiens, slik som kakaosmør, syntetiske glyseridestere eller polyetylenglykoler som er faste ved vanlige temperaturer, men som forvæskes og/eller oppløses i det rektale hulrom for å frigi legemidlet.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres oralt til mennesker i et doseringsområde på 1 til 100 mg/kg kroppsvekt i oppdelte doser. Et foretrukket doseområde er 0,1 til 10 mg/kg kroppsvekt oralt i oppdelte doser. Et annet foretrukket doseområde er 0,1 til 20 mg/kg kroppsvekt oralt i oppdelte doser. For kombinasjonsterapi med nukleoside analoger er et foretrukket doseområde 0,1 til 20 mg/kg kroppsvekt for forbindelsene ifølge oppfinnelsen administrert oralt i oppdelte doser, og 50 mg til 5 g/kg kroppsvekt for nukleosidanaloger administrert oralt i oppdelte doser. Det skal imidlertid forstås at det spesifikke dosenivå og doseringshyppighet for enhver bestemt pasient kan variere og vil avhenge av et utall faktorer innbefattende aktiviteten av den spesifikke forbindelse som anvendes, den metabolske stabilitet og lengden av virkningen av denne forbindelse, alder, kroppsvekt, generell helse, kjønn, diett, administreringstid og -måte, utskillel-sesgrad, legemiddelkombinasjon, strengheten av den bestemte tilstand og den vert som gjennomgår behandling.

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot kombinasjoner av HIV-revers transkriptaseinhibitorforbindelsene med ett eller flere midler som er anvendbare ved behandling av AIDS. Eksempelvis kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen administreres effektivt, enten ved perioder for preeksponering og/eller posteksponering, i kombinasjon med effektive mengder av AIDS-antivirale midler, immunmodulatorer, antiinfektive midler eller vaksiner, slik som de som er angitt i den etter-følgende tabell.

Det skal forstås at rammen for kombinasjoner av forbindelsene ifølge oppfinnelsen med AIDS-antivirale midler, immunmodulatorer, antiinfektive midler eller vaksiner ikke er begrenset til listen i den ovenfor angitte tabell, men innbefatter i prinsippet enhver kombinasjon med ethvert farmasøyt-isk preparat som er anvendbart for behandling av AIDS. Eksempelvis kan en forbindelse av formel I eller formel II hen-siktsmessig administreres i kombinasjon med en nukleosidanalog med kjent biologisk aktivitet overfor HIV-revers transkriptase. Egnede nukleosidanaloger er generelt kjedeavsluttere og innbefatter AZT, ddC, ddl, D4T, HEPT og 3'-fluor-2',3'-dideok-sytymidin.

AZT syntetiseres ved metodene ifølge J.P. Horwitz et al., J. Org. Chem. 29, 2076 (1964); R.P. Glinski et al., J. Org. Chem. 38, 4299 (1973); C.K. Chu et al., Tetrahedron Let-ters 29, 5349 (1988). Anvendelse av AZT som et terapeutisk legemiddel ved behandling av AIDS er beskrevet i U.S. 4 724 232.

Forbindelse ddC syntetiseres ved metodene ifølge J.P. Horwitz et al., J. Org. Chem. 32, 817 (1967); R. Marumoto, Chem. Pharm. Bull. 22, 128 (1974); og T.-S. Lin et al., J. Med. Chem. 30, 440 (1987).

D4T syntetiseres ved metodene ifølge Herdewijn, P. et al., J. Med. Chem. 30, 1270 (1987).

HEPT syntetiseres ved metodene ifølge Miyasaka, T. et al., J. Med. Chem. 32, 2507 (1989); og A. Rosowsky, J. Med. Chem. 24, 1177 (1981). Syntesen av ddC, ddl og AZT er også beskrevet i EPO 484071.

Forbindelsen 3'-fluor-2',3'-dideoksytymidin syntetiseres ved prosedyren ifølge Herdewijn, P. et al., J. Med. Chem. 30, 1270 (1987). Forbindelsen L-735.524 er N-(2(R)-hydroksy-1(S)-indanyl)-2(R)-fenylmetyl-4-(S)-hydroksy-5-(1-(4-(3-pyri-dylmetyl)-2(S)-N'-(t-butylkarboksamido)-piperazinyl))-pentan-amid, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. L-697.661 eller '661' er 3-([(4,7-diklor-l,3-benzoksazol-2-yl)metyl]-amino)-5-etyletyl-6-metylpyridin-2(lH)-on; L-696.229 er 3-[2-(1,3-benzoksazol-2-yl)-etyl]-5-etyl-6-metylpyridin-2(lH)-on. Syntesen av L-697.661 og L-696.229 er beskrevet i EPO 484071 og EPO 462800, begge inkorporert her ved referanse.

Foretrukne kombinasjoner er samtidige, intermitter-ende eller alternerende behandlinger av L-743.726 med eller uten en inhibitor av HIV-protease. En eventuell tredje kompon-ent i kombinasjonen er en nukleosidinhibitor av HIV-revers transkriptase, slik som AZT, ddC eller ddl. En foretrukket inhibitor av HIV-protease er L-735.524. Andre foretrukne inhibitorer av HIV-revers transkriptase innbefatter L-697.661. Disse kombinasjoner har synergistisk effekt på begrensning av spredningen av HIV. Foretrukne kombinasjoner innbefatter føl-gende: (1) L-743.726 med L-735.524, og eventuelt hvilke som helst av L-697.661, AZT, ddl eller ddC; (2) L-743.726 og hvilke som helst av L-697.661, AZT, ddl eller ddC. Farmasøyt-isk akseptable salter av disse kombinasjoner er også innbefattet.

Eksempel 1

(+/-)- 4-( 1. 1. 1- trifluormetyl)- 4-( l- buten- 4- vl)- 6- klor- l. 4- dihydro- 2H- 3. l- benzoksazin- 2- on; ( forbindelse 15)

Trinn A: N-( 4- klorfenyl)- 2, 2- dimetylpropanamid

Til en 5-liters 3-halset rundkolbe med en topprører ble det tilsatt 127,57 g (1 mol) 4-kloranilin, 1200 ml CHC13 og 1200 ml mettet, vandig Na2C03-løsning. En tilsetningstrakt ble koblet til kolben og fylt med 129 ml (1,05 mol) 2,2-dimetyl-propanoylklorid. Syrekloridet ble dråpevis tilsatt til den kraftig omrørte blanding i løpet av 1 time. Den resulterende blanding ble omrørt ved omgivende temperatur i ytterligere 23 timer. Noe av produktet utskiltes fra blandingen som hvite krystaller. Disse krystaller ble oppsamlet ved filtrering. Filtratet ble overført til en skilletrakt, og lagene ble separert. Kloroformlaget ble vasket med vann og saltvann. Tørking (MgS04), filtrering og fjerning av løsningsmidlet i vakuum ga ytterligere produkt. De to porsjoner av produkt ble kombinert og omkrystallisert fra kokende EtOAc-heksaner under dannelse av 185,6 g N-(4-klorfenyl)-2,2-dimetylpropanamid som et hvitt, krystallinsk, fast materiale.

Trinn B: 1-( 2- amino- 5- klorfenvl)- 2, 2. 2- trifluoretanon

Til en ovnstørket, 3-liters 3-halset rundkolbe utstyrt med topprører, argoninnløp og en 500 ml ovnstørket tilsetningstrakt ble det tilsatt 100 g (472 mmol) N-(4-klor-fenyl)-2,2-dimetylpropanamid og 1 1 tørt THF. Denne løsning ble avkjølt på et isbad til 0°C, og tilsetningstrakten ble fylt med n-butyllitium (387 ml av en 2,5 M-løsning i heksan,

986 mmol). n-butyllitiumløsningen ble dråpevis tilsatt langsomt til amidløsningen i løpet av 1 time idet temperaturen ble holdt under +5°C. Den resulterende løsning ble aldret ved 0°C i 1 time, under hvilket tidsrom et oransje bunnfall ble dannet. Til denne blanding ble det tilsatt 115 ml (986 mmol) etyl-1,1,1-trifluoracetat dråpevis i løpet av 1 time. Den resulterende, klare løsning ble aldret i ytterligere 30 minutter.

Reaksjonen ble stanset med 5% vandig HC1. Blandingen ble fortynnet med 1 1 EtOAc, og lagene ble separert. Den organiske fase ble vasket med saltvann, ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert i vakuum under dannelse av 160 g av en gul olje. Dette materiale ble suspendert i 1 1 3N vandig HC1, og løsnin-gen ble oppvarmet til tilbakeløpskokning i 24 timer. Den av-kjølte løsning ble fortynnet med 1 1 EtOAc, og blandingen ble gjort basisk med konsentrert NH40H. Lagene ble separert, og den organiske fase ble vasket med saltvann, ble tørket (MgS04), filtrert, konsentrert i vakuum og kromatografert på 1,5 kg silikagel under anvendelse av 15% EtOAc i heksan som elueringsmiddel. Det kromatograferte materiale ble omkrystallisert fra kokende heksan under dannelse av 57 g (54%) rent l-(2-amino-5-klorfenyl)-2,2,2-trifluoretanon som klare, gule krystaller, sm.p.: 91-92°C. XH NMR (CDC13): 6 6,46 (br s, 2H), 6,69 (d, 1H, J=9,2 Hz), 7,32 (dd, 1H, J=2,4, 9,2 Hz), 7,70 (d, 1H, J=2,4 Hz).

Trinn C: (+/-)- 2-( 2- amino- 5- klorfenvl)- l. 1. 1- trifluor- 5-heksen- 2- ol

Til en 300 ml ovnstørket, 3-halset rundkolbe med en rørestav, argoninnløp, tilsetningstrakt og tilbakeløpskjøler ble det tilsatt 3,03 g (125 mmol) magnesiumringer og 75 ml tørt THF. Til denne godt omrørte blanding ble det tilsatt 12,0 ml (118,21 mmol) 4-brom-l-buten i en slik hastighet at en forsiktig tilbakeløpskokning ble opprettholdt. Når tilsetnin-gen var fullført, ble blandingen aldret i 30 minutter og ble deretter avkjølt til 0°C på et isbad. Til denne godt omrørte løsning ble det tilsatt en løsning av 5,00 g (22,36 mmol) 1-(2-amino-5-klorfenyl)-2,2,2-trifluoretanon i 35 ml THF dråpevis i løpet av 30 minutter. Kjølebadet ble fjernet, og blandingen ble omrørt i 20 timer ved omgivende temperatur. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med EtOAc og 10% vandig sitronsyre. Denne blanding ble omrørt i 4 timer. Lagene ble separert, og den organiske fase ble vasket med vandig NaHC03 og saltvann. Tørking (MgS04), filtrering, fjerning av løsningsmid-let i vakuum og kromatografi på 300 g silikagel under anvendelse av 15% EtOAc i heksan som elueringsmiddel ga 4,80 g (+/-)-2-(2-amino-5-klorfenyl)-l,1,1-trifluor-5-heksen-2-ol som

et gult, fast materiale.

Trinn D: (+/-)-4-( 1, 1, 1- trifluormetyl)- 4-( l- buten- 4- yl)- 6-klor- 1. 4- dihydro- 2H- 3, l- benzoksazin- 2- on

Til en 200 ml rundkolbe utstyrt med rørestav, argon-innløp og en tilbakeløpskjøler ble det tilsatt 4,80 g (17,16 mmol) (+/-)-2-(2-amino-5-klorfenyl)-1,1,1-trifluor-5-heksen-2-ol, 13,91 g (85,81 mmol) 1,1'-karbonyldiimidazol og 75 ml tørt THF. Denne blanding ble oppvarmet til 60°C i

18 timer. Den avkjølte reaksjonsblanding ble fortynnet med EtOAc og ble vasket med 3 x 200 ml H20 og 250 ml saltvann. Tørking (MgS04), filtrering, fjerning av løsningsmidlet i

vakuum, etterfulgt av omkrystallisering fra kokende EtOAc-heksan ga 3,22 g (+/-)-4-(1,1,1-trifluormetyl)-4-(l-buten-4-yl)-6-klor-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on som et hvitt, krystallinsk, fast materiale, sm.p.: 165-166°C. XH NMR (CDC13): 6 1,99 (m, 1H), 2,09-2,40 (m, 3H), 5,00 (d, 1H, J=l,4 Hz), 5,03 (dd, 1H, J=l,4, 7,9), 5,78 (m, 1H), 6,85 (d, 1H), J=8,6 Hz), 7,21 (br s, 1H), 7,35 (dd, 1H, J=2,2, 8,6 Hz), 9,63 (br s, 1H).

Eksempel 2

( +/-)- 6- klor- 4- etvnvl- 4-( 1. 1. 1- trifluormetyl)- 1. 4- dihvdro- 2H-3. l- benzoksazin- 2- on ( forbindelse 26)

Trinn A: 2-( 2- amino- 5- klorfenyl)- l, 1, 1- trifluor- 3- butyn- 2- ol

En 500 ml 3-halset rundkolbe utstyrt med en tilsetningstrakt, argoninnløp, rørestav og digitaltermometer, ble fylt med etynylmagnesiumbromid (0,5 M i heksan; 268 ml,

134 mmol) og ble deretter avkjølt til -78°C. Dråpevis tilsetning av en løsning av 6,0 g (26,8 mmol) 1-(2-amino-5-klor-fenyl)-2,2,2-trifluoretanon i 50 ml THF ble fullført etter 15 minutter, idet temperaturen ble holdt ved _< -55°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 16 timer etter langsom oppvarming til romtemperatur. Den mørkerøde løsning ble ved -5°C dråpevis tilsatt 60 ml mettet, vandig ammoniumkloridløsning. Etylace-tatekstraksjon etterfulgt av vasking med 10% sitronsyre, mettet natriumbikarbonat, vann og saltvann ga 8,5 g urent produkt etter tørking over natriumsulfat, filtrering og fordampning av

løsningsmidlet. Rensing via flashkromatografi under anvendelse av 15-20% etylacetat:heksan ga ren 2-(2-amino-5-klorfenyl )-1,1,1-trifluor-3-butyn-2-ol (5 g lysebrun olje, 75% utbytte).

Trinn B: (+/-)- 6- klor- 4- etynyl- 4-( 1. 1. 1- trifluormetyl)- l, 4-dihydro- 2H- 3. l- benzoksazin- 2- on

En THF-løsning av 5,0 g 2-(2-amino-5-klorfenyl)-1,1,1-trifluor-3-butyn-2-ol (20,0 mmol i 225 ml THF) ble behandlet med 13,0 g (80,0 mmol) 1,1'-karbonyldiimidazol og ble oppvarmet i et oljebad til 60°C i 17 timer. THF ble fjernet i vakuum, residuet ble oppløst i etylacetat og ble deretter vasket med 10% sitronsyre, natriumbikarbonat, vann og saltvann før tørking over natriumsulfat. Etter filtrering og fordampning i vakuum ble det urene produkt isolert (3,6 g) og ble omkrystallisert fra etylacetat:heksan. Produktet, (+/-)-6-klor-4-etynyl-4-(1,1,1-trifluormetyl)-l,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazin-2-on, ble isolert som et hvitt, krystallinsk, fast materiale (3,22 g, 58,4% utbytte): sm.p.: 226-227°C. 1H-NMR (CDC13 + spor DMSO): 6 3,16 (s, 1H), 6,98 (d, J=3,3 Hz, 1H), 7,35 (m, 1H), 7,51 (s, 1H), 10,66 (s, 1H).

Eksempel 3

( + /-)- 6- klor- 4-( 1. 1. l- trifluormetvl)- 4- r( 3-( 1- pyrrolidinvl))-1- propynyll- 1, 4- dihydro- 2H- 3. l- benzoksazin- 2- on ( forbindelse 21

En dioksanløsning av 150 mg (0,544 mmol) (+/-)-6-klor-4-etynyl-4-(1,1,1-trifluormetyl)-l,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazin-2-on, 52,2 ul (0,626 mmol) pyrrolidin, 20,5 mg (0,681 mmol) paraformaldehyd, 31,1 ul (0,544 mmol) eddiksyre og 20,5 mg kopper(I)klorid (0,207 mmol i 3,5 ml dioksan) ble oppvarmet til 50°C i et oljebad i ca. 2 timer. Reaksjonsblandingen ble helt over i 2N HC1 og ble ekstrahert med etylacetat. Det vandige lag ble nøytralisert med fast kaliumkarbonat og ble ekstrahert tre ganger med etylacetat. De kombinerte ekstrakter ble vasket med vann og saltvann før tørking over natriumsulfat under dannelse av 140 mg urent produkt. Kromato-grafisk rensing på silikagel og omkrystallisering fra etylacetat: heksan ga krystallinsk (+/-)-6-klor-4-( 1,1,1-trifluormetyl)-4-[(3-(1-pyrrolidinyl) )-l-propynyl]-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazin-2-on (89 mg, 46% utbytte): sm.p.: 160-161°C (spaltn.) XH-NMR (CDCI3): 6 1,85-1,89 (m, 4H), 2,68-2,71 (m, 4H), 3,67 (s, 1H), 6,88 (d, J=8,55 Hz, 1H), 7,40 (dd, J=2,19, 8,54 Hz, 1H) 7,55 (s, 1H), 9,45 (s, 1H).

(+ /-)- 6- klor- 4-( 2- cvanofenyl) etynyl- 4-( 1, 1. 1- trifluormetyl) - 1. 4- dihvdro- 2H- 3. l- benzoksazin- 2- on ( forbindelse 2)

En løsning av 138 mg (0,5 mmol) 6-klor-4-etynyl-4-(1,1,1-trifluormetyl)-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on i 3 ml tørt THF ble omrørt ved -78°C. Til denne løsning ble det tilsatt 0,4 ml (1,0 mmol) n-butyllitium, 2,5 M i heksan. Anionet ble aldret i 10 minutter ved -78°C, hvoretter 1 ml ZnCl2- (1 M i eter) løsning ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -78°C i 15 minutter, isbadet ble fjernet og blandingen ble langsomt oppvarmet til 0°C i løpet av 30 minutter. Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt en løsning av

149 mg (0,65 mmol) 2-jodbenzonitril i 2 ml THF, etterfulgt av 56 mg (0,05 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)palladium(0). Reaksjonsblandingen fikk oppvarmes til romtemperatur og ble omrørt i 15 timer. Reaksjonsblandingen ble tilsatt 10 ml 2N HC1, ble ekstrahert med 2 x 200 ml EtOAc, og de kombinerte ekstrakter ble vasket med H20, saltvann og ble tørket over MgS04. Løs-ningsmidlet ble fjernet under dannelse av 195 mg av en olje som ble flashkromatografert på silikagel (20% EtOAc i heksan) under dannelse av 60 mg av det uomsatte utgangsmateriale og 35 mg av det koblede produkt. Det sistnevnte ble triturert med eter under dannelse av 25 mg (+/-)-6-klor-4-(2-cyanofenyl)-etynyl-4-( 1,1,1-trif luormetyl )-l, 4-dihydro-2H-3,1-benzoksazin-2-on. Sm.p.: 245-246°C. FAB MS M+l=377 m/e. XH NMR (CDC13) : 6 6,82-6,85 (d, J=8,5 Hz, 1H); 7,40-7,44 (dd, J=2,l, 8,5 Hz, 1H); 7,56-7,79 (m, 5H); 8,00 (s, 1H).

Eksempel 4

(+/-)- 4-( 1- klor- l. 1- difluormetvl)- 4-( 2- fenvletvnyl)- 6- klor-l, 4- dihydro- 2H- 3, l- benzoksazin- 2- on ( forbindelse 5)

Trinn A: 1-( 2- amino- 5- klorfenyl)- 2- klor- 2, 2- difluoretanon

Til en ovnstørket, 300 ml 3-halset rundkolbe med mag-netisk rørestav, argoninnløp og en 100 ml ovnstørket tilsetningstrakt ble det tilsatt 10 g (47,2 mmol) N-(4-klorfenyl)-2,2-dimetylpropanamid og 100 ml tørt THF. Denne løsning ble avkjølt på et isbad til 0°C, og tilsetningstrakten ble fylt med n-butyllitium (38,7 ml av en 2,5 M-løsning i heksan,

96,8 mmol). n-butyllitiumløsningen ble dråpevis tilsatt til amidløsningen langsomt i løpet av 1 time, idet temperaturen ble holdt under +5°C. Den resulterende løsning ble aldret ved 0°C i 1 time under hvilket tidsrom et oransje bunnfall ble dannet. Til denne blanding ble det tilsatt 10,2 ml (96,8 mmol) etyl-l-klor-1,1-difluoracetat dråpevis i løpet av 15 minutter. Den resulterende, klare løsning ble aldret i ytterligere 30 minutter. Reaksjonen ble stanset med 5% vandig HC1. Blandingen ble fortynnet med 1 1 EtOAc, og lagene ble separert. Den organiske fase ble vasket med saltvann, ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert i vakuum under dannelse av 160 g av en gul olje. Dette materiale ble suspendert i 200 ml 3N vandig HC1, og løsningen ble oppvarmet til tilbakeløpskokning i 24 timer. Den avkjølte løsning ble fortynnet med 500 ml EtOAc, og blandingen ble gjort basisk med konsentrert NH40H. Lagene ble separert og den organiske fase ble vasket med saltvann, ble tørket (MgS04), filtrert, konsentrert i vakuum og kromatografert på 350 g silikagel under anvendelse av 15% EtOAc i heksan som elueringsmiddel. Det kromatograferte materiale ble omkrystallisert fra kokende heksan under dannelse av 5,5 g urent l-(2-amino-5-klorfenyl)-2-klor-2,2-difluoretanon som klare, gule krystaller, sm.p.: 55-56°C. XH NMR (CDC13): 6 6,43 (br s, 2H), 6,69 (d, 1H, J=9,0 Hz), 7,31 (dd, 1H, J=2,4, 9,0 Hz), 7,80 (d, 1H, J=2,4 Hz).

Trinn B: (+/- )- 2-( 2- amino- 5- klorfenyl)- 4- fenyl- l- klor- l, 1- di-fluor- 3- butyn- 2- ol

Til en 100 ml ovnstørket, 3-halset rundkolbe med en rørestav, argoninnløp, tilbakeløpskjøler og en membran ble det tilsatt 2,13 g (20,83 mmol) etynylbenzen, 50 ml tørt THF og etylmagnesiumbromid (6,94 ml av en 3,0M-løsning i eter). Denne blanding ble aldret i 2 timer ved omgivende temperatur hvorpå en løsning av 1,00 g (4,17 mmol) l-(2-amino-5-klorfenyl)-2-klor-2,2-difluoretanon i 6 ml THF ble tilsatt med en sprøyte. Den resulterende oransjerøde løsning ble omrørt ved omgivende temperatur i 21,5 timer. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 50 ml 1N-HC1, og blandingen ble deretter fortynnet med EtOAc. Løsningen ble deretter gjort basisk med konsentrert NH40H, og lagene ble separert. Den organiske fase ble vasket med vann og saltvann. Tørking (MgS04), filtrering, fjerning av løsningsmidlet i vakuum og kromatografi på silikagel under anvendelse av 20% EtOAc i heksan som elueringsmiddel ga 1,02 g (+/-)-2-(2-amino-5-klorfenyl)-4-fenyl-l-klor-1,1-difluor-3-butyn-2-ol som et off-hvitt, fast materiale. 1H NMR (CDC13): 6 4,42 (br s, 2H), 5,10 (br s, 1H), 6,65 (d, 1H, J=8,5 Hz), 7,15 (dd, 1H, J=2,4, 8,5 Hz), 7,38 (m, 3H), 7,55 (m, 2H), 7,70 (d, J=2,4 Hz).

Trinn C: (+/-)- 4-( 1- klor- l. 1- difluormetyl)- 4-( 2- fenyletynyl)-6- klor- l, 4- dihydro- 2H- 3, l- benzoksazin- 2- on

Til en 100 ml rundkolbe med en rørestav, tilbakeløps-kjøler og et argoninnløp ble det tilsatt 0,81 g (2,37 mmol)

(+/-)-2-(2-amino-5-klorfenyl)-4-fenyl-l-klor-1,1-difluor-3-butyn-2-ol, 25 ml tørt THF og 1,919 g (11,84 mmol) 1,1'-karbonyldiimidazol. Denne løsning ble oppvarmet til 60°C i 20 timer. Den avkjølte reaksjonsblanding ble fortynnet med EtOAc og ble vasket med 0,5N-HC1, H20 og saltvann. Tørking (MgS04), filtrering og fjerning av løsningsmidlet i vakuum ga 890 mg av en olje. Dette materiale ble kromatografert på 80 g silikagel under anvendelse av 20% EtOAc i heksan som elueringsmiddel. Det kromatograferte materiale ble omkrystallisert fra kokende EtOAc-heksan under dannelse av 507 mg (58%) (+/-)-4-(1-klor-l,1-difluormetyl)-4-(2-fenyletynyl)-6-klor-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on som hvite nåler, sm.p.: 154-155°C. XH NMR (CDC13): 6 6,89 (d, 1H, J=8,4 Hz), 7,35-7,48 (m, 4H), 7,56 (m, 2H), 7,64 (br s, 1H), 9,19 (br s, 1H).

Eksempel 5

(-)- 6- klor- 4- fenyletynyl- 4- trifluormetyl- 1, 4- dihydro- 2H- 3, 1-benzoksazin- 2- on ( forbindelse 4)

Trinn A: 2-( 2- amino- 5- klorfenyl)- 4- fenyl- 1, 1. 1- trifluor- 3-butvn- 2- ol

En løsning av litiofenylacetylid, fremstilt fra

4,83 ml fenylacetylen (0,044 mol) og 17,2 ml av en 2,5N-løs-ning av n-butyllitium i heksan (0,043 mol) i 50 ml THF ved -78°C, ble behandlet med 11,4 g magnesiumbromideterat (0,044 mol) i løpet av 5 minutter. Blandingen ble oppvarmet til -20°C, og omrøringen under argon ble fortsatt i 30 minutter. Blandingen ble deretter avkjølt til -60°C, og en løsning inneholdende 2,5 g (0,011 mol) l-(2-amino-5-klor)-2,2,2-tri-fluormetyletanon på forhånd kompleksdannet med en ekvivalent (2,8 g, 0,011 mol) magnesiumbromideterat i 25 ml THF, ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 15° i én time før den ble avkjølt til 0°C og ble dråpevis behandlet med en blanding av 30 ml hver av mettet, vandig ammoniumkloridløsning og vann. Blandingen ble ekstrahert med 2 x 100 ml porsjoner av etyl-eter, de kombinerte, organiske faser ble vasket med saltvann og ble tørket over MgS04. Fjerning av tørkemidlet og løsnings-midlet ga 6 g av en olje som ble flashkromatografert på silikagel og ble eluert med 20% EtOAc i heksan, under dannelse av 2,5 g 2-(2-amino-5-klorfenyl)-4-fenyl-1,1,1-trifluor-3-butyn-2-ol. 1H-NMR (CDC13): 6 4,63 (br s, 3H), 6,69 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,15 (d, J=2 Hz, 1H), 7,17 (d, J=2 Hz, 1H) 7,35-7,44 (m, 3H), 7,53-7,56 (m, 2H), 7,66 (d, J=2 Hz, 1H). FAB MS M+H = 326 m/e.

Trinn B: ( ±)- 6- klor- 4- fenyletvnyl- 4- trifluormetyl- 1. 4- dihvdro-2H- 3. l- benzoksazin- 2- on ( forbindelse 12)

En løsning av 2,0 g (6,1 mmol) 2-(2-amino-5-klor-fenyl)-4-fenyl-1,1,1-trifluor-3-butyn-2-ol og 11,0 g (12,0 mmol) 1,1'-karbonyldiimidazol i 300 ml tørt THF ble om-rørt under argon ved 55°C i 24 timer. Løsningsmidlet ble fjernet på en rotasjonsfordamper, og residuet ble fordelt mellom 200 ml eter og 400 ml vann. Lagene ble separert, og det vandige lag ble ekstrahert ytterligere én gang med eter. De kombinerte eterekstrakter ble vasket med 2 x 200 ml 10% sitronsyre og deretter med saltvann før tørking over MgS04. Fjerning av tørkemiddel og løsningsmiddel ga 1,5 g (70%) av den urene tittelforbindelsen som en olje. Triturering med eter-heksan ga 875 mg (±)-6-klor-4-fenyletynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on som et hvitt, fast materiale som del-vis smeltet ved 137°C og var klart ved 147°C. 1H-NMR (CDC13): 6 6,92 (d, J=8 Hz, 1H), 7,30-7,49 (m, 4H), 7,58-7,65 (m, 3H), 8,99 (s, 1H).

Trinn C: 6- klor- l-( IS)- kamfanovl- 4- fenyletynyl- 4- trifluormetyl- 1 , 4- dihydro- 2H- 3, l- benzoksazin- 2- on

Til en løsning inneholdende 2,24 g (6,37 mmol) (±)-6-klor-4-fenyletynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazin-2-on, 0,10 g (0,8 mmol) 4-dimetylaminopyridin og 2,07 g (9,55 mmol) (-) kamfansyreklorid i 60 ml tørt diklormetan, omrørt under argon på et isbad, ble tilsatt 2,22 ml

(15,9 mmol) trietylamin. Kjølebadet ble fjernet, og reaksjonen fikk forløpe ved romtemperatur. Når reaksjonen var fullført ved tynnsjiktskromatografi (Si02, 4% EtOAc i CHC13), ble løs-ningen fortynnet med 200 ml CHC13 og ble vasket to ganger med 10% sitronsyre og deretter med saltvann. Etter tørking (MgS04) ble løsningsmidlet fjernet på en rotasjonsfordamper, og det skumaktige residuum ble underkastet flashkromatografi og eluering med CHC13. Det ble erholdt 575 mg av diastereomer I av 6-klor-(IS)-kamfanoyl-4-fenyletynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on som en olje, 1H-NMR (CDC13): 6 0,85 (s, 3H), 1,08 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 1,73-1,85 (m, 1H), 1,92-2,08 (m, 1H), 2,450-2,67 (m, 2H), 7,30-7,79 (m, 8H). Dette ble etterfulgt av 1,52 g av blandede fraksjoner (diastereomerer I og II). Fortsatt eluering ga 680 mg av den langsommere bevege-lige diastereomer (II) av tittelforbindelsen som etter triturering med en eter/heksan-blanding ga klumper av hvite nåler, sm.p. 177-178,5°C; 1H-NMR (CDC13): 6 0,83 (s, 3H), 1,12 (s, 3H), 1,23 (s, 3H), 1,73-1,86 (m, 1H), 1,93-2,06 (m, 1H), 2,50-2,63 (m, 2H), 7,38-7,51 (m, 4H), 7,49-7,62 (m, 2H) 7,72 (d, J=9 Hz, 1H), 7,76 (d, J=2 Hz, 1H).

1,52 g av isomerblandingen fra flashkromatografien ble oppløst i 75 ml eter, løsningen ble fortynnet med 50 ml

heksan og ble deretter sådd med en krystall av isomer II. Langsom krystallisering ga ytterligere 385 mg isomer II som ble omkrystallisert fra eter/heksan under dannelse av >96% diastereomert rent materiale ved HPLC.

Trinn D: ( - )- 6- klor- 4- fenyletvnyl- 4- trif luormetyl- 1, 4- dihydro-2H- 3. l- benzoksazin- 2- on 53 mg (0,10 mmol) av den krystallinske diastereomer (II) av 6-klor-l-(IS)-kamfanoyl-4-fenyletynyl-4-trifluormetyl-1,2-dihydro-4(H)-3,l-benzoksazin-2-on ble oppløst i 8 ml 2-propanol ved 45°C under en argonatmosfære. Til løsningen ble det tilsatt 0,27 ml av en 10% vandig løsning av K2C03. Omrørin-gen ble fortsatt i 10 minutter ved hvilket tidspunkt alt av utgangsmaterialet var forbrukt (TLC, Si02, 4% EtOAc i CHC13). Løsningen ble konsentrert i vakuum, og residuet ble tatt opp i eter. Etter vasking med 0,1N-HC1 og saltvann ble eterløsningen tørket (MgS04), filtrert og fordampet i vakuum til et oljeak-tig, fast materiale som ble renset ved Si02-kromatografi med 5% 2-propanol i heksan som elueringsmiddel. (-)-6-klor-4-fenyletynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on ble erholdt som hvite nåler fra eter/heksan, sm.p.: 178-179°C; [a]D20 = -92,5° (CHC13, c=0,0012 g ml'1); 1H-NMR (CDC13): 6 6,87 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37-7,50 (m, 4H), 7,56-7,63 (m, 3H), 8,60 (s, 1H).

Trinn E: ( + )- 6- klor- 4- fenyletvnyl- 4- trif luormetyl- 1. 4- dihydro-2H- 3. l- benzoksazin- 2- on ( forbindelse 3)

(+ )-6-klor-4-fenyletynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on ble fremstilt fra det ikke-krystallinske produkt fra trinn C, diastereomer I, på samme måte som i trinn D: sm.p.: 178-179°C; [a]D20 = +87, 6° (CHC13, c=0,0050 g ml"1; XH-NMR (CDC13): 6 6,87 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37-7,50 (m, 4H), 7,56-7,63 (m, 3H), 8,60 (s, 1H).

Eksempel 6

(-)- 6- klor- 4- svklopropvletvnyl- 4- trifluormetvl- 1, 4- dihydro— 2H-3. l- benzoksazin- 2- on ( L- 743. 726, forbindelse 37, 2) og (+)-6-klor- 4- svklopropyletynvl- 4- trifluormetyl- 1, 4- dihydro- 2H-- 3, 1-benzoksazin- 2- on ( L- 743. 725)

Trinn A: 2-( 2- amino- 5- klorf enyl)- 4- syklopropyl- l, 1. 1- trif luor-3- butvn- 2- ol

En løsning av brommagnesiumsyklopropylacetylid ble fremstilt fra 23 g syklopropylacetylen (0,348 mol) i 250 ml THF ved dråpevis tilsetning av 116 ml av en 3,0M-løsning av etylmagnesiumbromid i eter (0,348 mol) i løpet av 1 time. Denne løsning ble opprettholdt ved 0°C i 1 time og deretter ved 40°C i 3 timer. Til denne løsning, avkjølt på nytt til 0°C, ble det tilsatt porsjonsvis 15,56 g l-(2-amino-5-klorfenyl)-2,2,2-trifluormetyletanon (0,0696 mol) som et fast materiale i løpet av 5 minutter. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0° i 1,5 time. Reaksjonen ble stanset ved 0°C ved dråpevis tilsetning av 700 ml mettet, vandig ammoniumkloridløsning. Blandingen ble ekstrahert med 2 x 400 ml porsjoner av etylacetat, de kombinerte, organiske faser ble vasket med saltvann og ble tørket over MgS04. Fjerning av tørkemidlet og løsningsmidlene ga et gult, fast materiale. Dette materiale ble omkrystallisert fra kokende heksan (100 ml sluttvolum) under dannelse av 14,67 g 2-( 2-amino-5-klorfenyl)-4-syklopropyl-l,1,1-trifluor-3-butyn-2-ol. En andre masse (2,1 g) ble erholdt ved konsen-trering av modervæskene. Sm.p.: 153-154°C. 1H-NMR (CDC13): 6 0,84 (m, 2H), 0,90 (m, 2H), 1,38 (m, 1H), 4,50 (br s, 3H), 6,69 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,13 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,55 (d, J=2,5 Hz, 1H).

Trinn B: ( ±)- 6- klor- 4- syklopropyletynvl- 4- trifluormetyl- 1. 4-dihvdro- 2H- 3, l- benzoksazin- 2- on ( L- 741. 211)

En løsning av 15,00 g (0,0518 mol) 2-(2-amino-5-klor-fenyl)-4-syklopropyl-l,1,1-trifluor-3-butyn-2-ol og 41,98 g (0,259 mol) 1,1'-karbonyldiimidazol i 250 ml tørt THF ble om-rørt under argon ved 55°C i 24 timer. Løsningsmidlet ble fjernet på en rotasjonsfordamper, og residuet ble fordelt mellom 500 ml etylacetat og 400 ml vann. Lagene ble separert, og den vandige fase ble ekstrahert ytterligere én gang med etylacetat. De kombinerte etylacetatekstrakter ble vasket med 2 x 200 ml 2% vandig HC1, mettet, vandig NaHC03 og saltvann. Tørk-ing over MgS04, filtrering og fjerning av løsningsmidlet i vakuum ga 16,42 g av tittelforbindelsen som et fast materiale. Omkrystallisering fra etylacetat-heksan ga 12,97 g av analyt-isk rent (±)-6-klor-4-syklopropyletynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on som hvite krystaller, sm.p.: 178-180°C. ^-NMR (CDC13): 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

Trinn C: 6- klor- l-( IS)- kamfanoyl- 4- syklopropyletynvl- 4- trifluormetvl- 1. 4- dihydro- 2H- 3. l- benzoksazin- 2- on

Til en løsning inneholdende 12,97 g (0,041 mol) (±)-6-klor-syklopropyletynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazin-2-on, 1,02 g (0,0083 mol) 4-dimetylaminopyridin og 14,22 g (0,06556 mol) (-) kamfansyreklorid i 350 ml tørt diklormetan, omrørt under argon på et isbad, ble tilsatt

22,84 ml (0,164 mol) trietylamin. Kjølebadet ble fjernet, og reaksjonen fikk forløpe ved romtemperatur. Etter 75 minutter ble reaksjonen bedømt som fullført ved tynnsjiktskromatografi (Si02, 4% EtOAc i CHC13), og løsningen ble fortynnet med 500 ml CHC13 og ble deretter vasket to ganger med 10% sitronsyre, én gang med vann og én gang med saltvann. Tørking (MgS04), filtrering og fjerning av løsningsmidlet i vakuum ga et fargeløst skum. Dette materiale ble triturert med 200 ml kokende heksan. Ved avkjøling til romtemperatur ble det ønskede diastereomere kamfanatimid utfelt. Det faste materiale ble oppsamlet på en fritte, ble vasket med litt kald heksan og ble tørket i vakuum under dannelse av 7,79 g 6-klor-l-(IS)-kamfanoyl-4-syklopro-pyletynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on som hvite krystaller. Sm.p.: 164-165°C. HPLC-renhet: 99,2% @ 254 nm. 1H-NMR (CDC13): 6 0,77 (s, 3H), 0,86-0,96 (m, 4H), 1,08 (s, 3H), 1,19 (s, 3H), 1,44 (m, 1H), 1,76 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 2,51 (m, 2H), 7,42 (dd, J=2,4, 9,0 Hz, 1H), 7,63 (m, 2H).

Trinn D: (-)- 6- klor- 4- svklopropyletvnvl- 4- trifluormetvl- 1, 4-dihvdro- 2H- 3, l- benzoksazin- 2- on ( L- 743. 726, forbindelse 37. 2)

7,50 g (0,01512 mol) 6-klor-l-(IS)-kamfanoyl-l-syk-lopropyletynyl^-trif luormetyl-1,2-dihydro-4(H)-3,1-benzoksazin-2-on ble oppløst i 150 ml n-butanol ved 60°C under en argonatmosfære. Til denne løsning ble det tilsatt 10 ml IN HC1. Denne løsning ble opprettholdt ved 60°C i 72 timer. Blandingen ble nøytralisert med vandig NaHC03, hvoretter n-butanol ble fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i 150 ml THF og ble behandlet med 50 ml 2N LiOH i 3 timer ved romtemperatur. Denne blanding ble fortynnet med etylacetat og ble vasket med to porsjoner vann og én porsjon saltvann. Tørking (MgS04), filtrering og fjerning av løsningsmidlet i vakuum ga et hvitt, fast materiale. Dette materiale ble omkrystallisert f rei varm heksan under dannelse av 3,43 g (- )-6-klor-4-syklopropyl-etynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on som hvite krystaller, sm.p.: 131-132°C; [a] D20=-84,7° (CHC13, c=0,005 g ml"1); 1H-NMR (CDC13): 6 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

Trinn E: (+)- 6- klor- 4- svklopropyletvnvl- 4- trifluormetvl- 1, 4-dihvdro- 2H- 3. l- benzoksazin- 2- on ( L- 743. 725 )

Modervæskene fra trinn C ovenfor ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel under anvendelse av 10% etylacetat i heksan som elueringsmiddel. Den rene, ikke-ønskede diastereomer (et fargeløst skum) ble hydrolysert i henhold til trinn D. Det enantiomere benzoksazinon, (+)-6-klor-4-syklopro-pyletynyl-4-trifluormetyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on, ble erholdt som hvite krystaller, sm.p.: 131-132°C;

[a]D20=+84,4° (CHC13, c=0,005 g ml"1);1H-NMR (CDC13): 6 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

Revers transkriptase- utprøvning

Utprøvningen måler inkorporeringen av tritiert deok-syguanosinmonofosfat med rekombinant HIV-revers transkriptase (HIV RTR) (eller annen RT) i syreutfellbart cDNA ved Km-verdier på dGTP og poly r(C)-oligo d(G)12_18. Inhibitorene ifølge oppfinnelsen inhiberer denne inkorporering.

Utprøvningene ble utført i 55 mM Tris (pH 8,2)-30 mM KC1-30 mM MgCl2-l mM ditiotreitol-20 ug rC:dG12.18 (Pharmacia) pr. ml-8 mM [3H]dGTP (New England Nuclear)-0,01% "Triton X-100"-50 mM etylenglykol-bis(p-aminoetyleter)-N,N,N'N'-tetraed-diksyre (EGTA)-l mg kvegserumalbumin pr. ml. Etter 60 minut-ters inkubering ved 37°C ble syreutfellbart materiale oppsamlet på glassfiberfiltre ved anvendelse av en halvautomatisk cellehøster. Bakterielle celleekstrakter inneholdende RT, ble fortynnet til innen det lineære område av bestemmelsen, og aktiviteten ble bestemt i nærvær og i fravær av inhibitor. Renset HIV-1 RT-heterodimer fremstilt i E. coil, tjente også som en kontroll. Resultater er bestemt som inhibitorkonsentra-sjon som gir 50% inhibering (IC50 vekt), i nanomol/liter.

For den doble mutantbestemmelse (dm) ble A17 RT anvendt i bestemmelsen. A17 RT er resistent overfor forskjellige aminopyridoner som beskrevet i Nunberg, J.H. et al., J. Virol. 65, 4887 (1991). Resultater er målt som IC50 dm i nanomol/- liter.

Cellespredningsbestemmelse

Inhibering av spredningen av HIV i cellekultur ble målt i henhold til Nunberg, J. H. et al., J. virol. 65_, 4887

(1991). I denne bestemmelse ble MT-4 T-lymfoide celler infisert med HIV-1 (villtype, med mindre annet er angitt) under anvendelse av et på forhånd bestemt inokulum, og kulturene ble inkubert i 24 timer. Ved dette tidspunkt var <^ 1% av cellene positive ved indirekte immunfluorescens. Cellene ble deretter grundig vasket og fordelt i 96-brønns kulturskiver. Serievise, doble fortynninger av inhibitor ble tilsatt til brønnene, og dyrkningen ble fortsatt i ytterligere 3 dager. Ved 4 dagers postinfeksjon var 100% av cellene i kontrollkulturene infisert. HIV-1 p24-akkumulering var direkte korrelert med virusspredning. Den cellekultur-inhiberende konsentrasjon ble definert som inhibitorkonsentrasjonen i nanomol/liter som redus-erte spredningen av infeksjon med minst 95% eller CIC95.

Sammendrag av resultatene for forbindelse 37, 2

A. Revers transkriptase- utprøvning og celle-spredningsutprøvning;

B. Farmakologiske data:Rhesus: 1 mg kg"1 i.v.it1/2=210 min.

10 mg kg "1 p.o. (methocel): Cmax=4,4uM @ 2h * ^^j"c')" C24h=1,^M

Proteinbinding: 98,0% normalt, humant plasma (HPLC-metode)

* Mutantene K103N og Y181C er legemiddelresistente HIV-1-revers transkriptaser. DM er den doble mutant som diskutert i revers transkriptasebestemmelsen. RT-2 er revers transkriptase av HIV-2.

Synergistiske effekter

A. Fremstilling av HIV- infisert MT- 4- cellesuspension

MT-celler ble infisert ved dag 0 til en konsentrasjon på 250.000 pr. ml med en 1:1.000 fortynning av HIV-1 stamme Illb-forråd (sluttelig 125 pg p24/ml; tilstrekkelig til å gi

<1% infiserte celler på dag 1 og 25-100% på dag 4). Cellene ble infisert og dyrket i følgende medium: RPMI 1640 (Whittaker BioProducts), 10% inaktivert kalvefosterserum, 4 mM glutamin (Gibco Labs) og 1:100 "Penicillin-Streptomycin" (Gibco Labs).

Blandingen ble inkubert over natten ved 37°C i 5% C02-atmosfære.

B. Behandling med inhibitorer

En matriks av nanomolare områdekonsentrasjoner av de parvise kombinasjoner (se tabell S) ble fremstilt. Ved dag 1 ble aliquoter på 125 pl inhibitorer tilsatt til like volumer HIV-infiserte MT-4-celler (50.000 pr. brønn) i en 96-brønns mikrotitercellekulturplate. Inkubering ble fortsatt i 3 dager ved 37°C i 5% C02-atmosfære.

C. Måling av virusspredning

Under anvendelse av en multikanalpipette ble de av-satte celler resuspendert, og 125 pl ble høstet i en separat mikrotiterplate. Supernatanten ble undersøkt med hensyn på HIV p24-antigen.

Konsentrasjonen av HIV p24-antigen ble målt ved en enzymimmunbestemmelse beskrevet som følger. Aliquoter av p24-antigen som skulle måles, ble tilsatt til mikrobrønner belagt med et monoklonalt antistoff som var spesifikt overfor HIV-kjerneantigen. Mikrobrønnene ble vasket ved dette punkt og ved andre egnede trinn som fulgte. Biotinylert, HIV-spesifikt antistoff ble deretter tilsatt, etterfulgt av konjugert strepa-vidin-pepperrotperoksidase. En fargereaksjon fant sted fra det tilsatte hydrogenperoksid og tetrametylbenzidinsubstrat. Fargeintensiteten er proporsjonal med konsentrasjonen av HIV p24-antigen.

Beregning av graden av synergi

Parvise kombinasjoner av inhibitorer (se tabell 5) ble funnet å utvise markert forøkt inhibering av virusspredning sammenlignet med hver inhibitor alene, eller i sammenligning med den additive inhibering av hver inhibitor. Den parvise kombinasjon av f.eks. 726 og AZT ble funnet å utvise markert forøkt inhibering av virusspredning i sammenligning med 726 alene eller AZT alene, eller i sammenligning med summen av 726-inhibitor og AZT-inhibering.

Disse data ble bearbeidet som følger: fraksjonelle, inhiberende konsentrasjonsforhold (FIC) ble beregnet i henhold til Elion et al., J. Biol. Chem., 208, 477 (1954). Den mini-male sum av FICS som er den maksimale synergi, ble bestemt for forskjellige parvise kombinasjoner. Alternativt ble en midlere sum av FICS beregnet som er den midlere synergi. Se tabell S. Disse resultater indikerer vesentlig synergi ved inhibering av virusspredning. Jo mindre tallet er, jo større er synergien.

524 er L-735.524. Andre forbindelser er også definert i tabell C ovenfor.

Krav

1. Forbindelse, karakterisert ved formelen:hvori:X er halogen;XI er trihalometyl;Z er 0; R er(a) C1.8-alkyl, usubstituert eller substituert med A, og A er halogen, C3_6-sykloalkyl, CN, hydrok-SY> C^-alkoksy, fenyl, C^^-alkyl, C^-C^-alkok-sykarbonyl, ni tro, di(C1.2-alkyl )amino, pyrrolidin, oksazolidinon eller fenyltio;(b) C2.4-alkenyl, usubstituert eller substituert med(i) A, eller(ii) fenyl, usubstituert eller substituert med A;(c) C2.5-alkynyl, usubstituert eller substituert med(i) A, eller(ii) fenyl, usubstituert eller substituert medA;eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.2. Farmasøytisk preparat,karakterisert ved at det omfatter en effektiv mengde av en forbindelse av formel IIog en farmasøytisk akseptabel bærer,hvoriX er halogen;XI er trihalometyl; C2.5-alkyl; C3.5-sykloalkyl; ellerfenyl;Z er 0 eller S;R er(a) C1.8-alkyl, usubstituert eller substituert med A, og A er halogen, C3.6-sykloalkyl, CN, hydrok-SY, C^-alkoksy, fenyl, C1-C4-alkyl, C1-C4-alkok-sykarbonyl, nitro, di(C1.2-alkyl )amino, pyrrolidin, oksazolidinon eller fenyltio;(b) C2_4-alkenyl, usubstituert eller substituert med(i) A, eller(ii) fenyl, usubstituert eller substituert med A;(c) C2.5-alkynyl, usubstituert eller substituert med(i) A, eller(ii) fenyl, usubstituert eller substituert medA;eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er(-)-6-klor-4-syklopropyletynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on,(-)-6-klor-4-fenyletynyl-4-trifluormetyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on,(+/-)-6-klor-4-(2-cyanofenyl)etynyl-4-(1,1,l-trifluormetyl)-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on,(+/-)-4-(1-klor-l,1-difluormetyl)-4-(2-fenyletynyl) - 6-klor-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on, eller(+/-)-4-(2-[dimetylaminometyl]etynyl)-4-trifluormetyl -6-klor-l ,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazin-2-on,eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.4. Farmasøytisk preparat anvendbart for inhibering av HIV-revers transkriptase,karakterisert ved at det omfatter en effektiv mengde av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 3, og en farmasøytisk akseptabel bærer.5. Farmasøytisk preparat anvendbart for forhindring eller behandling av infeksjon med HIV eller for behandling av AIDS eller ARC,karakterisert ved at det omfatter en effektiv mengde av en forbindelse av formel I eller formel II eller ifølge krav 3, og en farmasøytisk akseptabel bærer.6. Kombinasjon, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse av formel I eller formel II med en nukleosidanalog med biologisk aktivitet overfor HIV-revers transkriptase.7. Synergistisk kombinasjon, karakterisert ved at den omfatter AIDS-antivirale forbindelser, som erog, eventuelt, én eller flere av HIV-inhibitorene valgt fra gruppen bestående 3-([(4,7-diklor-l,3-benzoksazol-2-yl)metyl]-amino)-5-etyl-6-metylpyridin-2(lH)-on, AZT, ddl eller ddC.8. Synergistisk kombinasjon, karakterisert ved at den omfatter AIDS-antivirale forbindelser, som erog én eller flere av HIV-inhibitorene valgt fra gruppen bestående av 3-([(4,7-diklor-l,3-benzoksazol-2-yl)metyl]amino)-5-etyl-6-metylpyridin-2(lH)-on, AZT, ddl eller ddC.
Hva betyr A1, B, B1, C osv? info
Merck & Co Inc
P O Box 100, NJ08889-0100 Whitehouse Station US
Merck & Co Inc
P O Box 100, NJ08889-0100 Whitehouse Station US
Lansdale, PA US
Norristown, PA US
Pennsburg, PA US
Lansdale, PA US
West Chester, PA US
Fullmektig i Norge:
ZACCO NORWAY AS
Postboks 488 0213 OSLO NO ( OSLO kommune, OSLO fylke )

Org.nummer: 982702887
Din referanse: 60282-HL
  • Foretaksnavn:
  • Foretaksform:
  • Næring:
  • Forretningsadresse:
     

Kilde: Brønnøysundregistrene

1992.08.07, US 926607

1993.04.27, US 54805

Statushistorie

Liste over statusendringer i sakshistorikk
Hovedstatus Beslutningsdato, detaljstatus
Patent opphørt Utløpt etter 20 år
Meddelt Detaljstatus ikke tilgjengelig

Korrespondanse

Liste over sakshistorikk og korrespondanse
Dato Type korrespondanse Journal beskrivelse
Utgående Patent expired (end of protection) (2013.08.13)
01-01 Brev UT Patent expired (end of protection) (2013.08.13)

Til betaling:

Betalingshistorikk:

Liste av betalinger
Beskrivelse / Fakturanummer Betalingsdato Beløp Betaler Status
Årsavgift 20. avg.år. 2012.07.26 5900 Master Data Center Inc Betalt og godkjent
Årsavgift 19. avg.år. 2011.07.21 5600 Master Data Center Inc Betalt og godkjent
Årsavgift 18. avg.år. 2010.07.08 4800 Master Data Center Inc Betalt og godkjent
Årsavgift 17. avg.år. 2009.07.08 4800 Master Data Center Inc
Årsavgift 16. avg.år. 2008.08.18 4800 Computer Patent Annuities Ltd
Årsavgift 15. avg.år. 2007.07.04 3900 Master Data Center Inc
Årsavgift 14. avg.år. 2006.07.07 3900 Master Data Center Inc
Årsavgift 13. avg.år. 2005.07.11 3900 Master Data Center Inc
Årsavgift 12. avg.år. 2004.07.09 2600 Master Data Center Inc
Årsavgift, år 11 0
Årsavgift, år 10 0
Årsavgift, år 9 0
Årsavgift, år 8 0
Årsavgift, år 7 0
Årsavgift, år 6 0
Årsavgift, år 5 0
Årsavgift, år 4 0
Årsavgift, år 1-3 0
Denne oversikten kan mangle informasjon, spesielt for eldre saker, om tilbakebetaling, internasjonale varemerker og internasjonale design.

Lenker til publikasjoner og Norsk Patenttidende (søkbare tekstdokumenter)

Siste publiserte versjon av patent (Dokumentet er ennå ikke tilgjengelig)
Allment tilgjengelig patentsøknad
Lenker til publikasjoner (ikke søkbare tekstdokumenter)
Hva betyr A1, B, B1, C osv? info
Kapitler uten data er fjernet. Melding opprettet: 18.07.2024 06:08:02